Résumé
   Le poisson Tetraodon nigroviridis possède un génome de 350 Mb, le plus petit génome connu à ce jour parmi les vertébrés. Cette caractéristique le rend très attractif pour des études génomiques, et elle a motivé le lancement d'un projet de séquençage au Genoscope en 1997, l'année même de la mise en route du centre. L'objectif initial du Genoscope était de comparer les séquences génomiques de ce poisson à celles de l'homme pour assister l'annotation des gènes humains et évaluer leur nombre. Cette stratégie est fondée sur l'héritage génétique commun des vertébrés : d'une espèce de vertébré à une autre, fussent-elles aussi distantes qu'un poisson et un mammifère, on retrouve en grande partie les mêmes gènes. Dans le cas du génome "compact" de Tetraodon, ce bagage commun de gènes est en outre compris dans un génome huit fois plus petit que le génome humain: alors que la longueur des exons est similaire chez les deux espèces, la taille des introns et des séquences intergéniques est fortement réduite chez le poisson. En outre, ces régions, à la différence des exons, ont complètement divergé depuis la séparation des lignées de l'homme et de Tetraodon. La méthode Exofish, développée au Genoscope, exploite ce contraste afin que les régions conservées identifiées par la comparaison des séquences génomiques correspondent aux seules régions codantes. Grâce aux premiers résultats du séquençage de Tetraodon, le Genoscope a évalué, en 2000, le nombre des gènes humains à environ 30 000, alors que des estimations bien plus élevées avaient cours. Les progrès de l'annotation du génome humain ont depuis étayé l'hypothèse du Genoscope, avec des valeurs aussi basses que 22 000 gènes et un consensus autour de 25 000 gènes.
Le séquençage du génome de Tetraodon, effectué conjointement par le Genoscope et le Whitehead Institute Center for Genome Research (aujourd'hui Broad Institute) à une profondeur d'environ 8X, s'est achevé en 2002, avec un assemblage couvrant 90% de l'euchromatine du poisson. Cela a permis une application d'Exofish à plus grande échelle dans des comparaisons avec le génome de l'homme, mais aussi avec ceux de deux autres vertébrés séquencés (le poisson Takifugu, proche parent de Tetraodon, et la souris). Les régions conservées ainsi détectées ont été intégrées dans la procédure d'annotation avec d'autres ressources (séquences d'ADNc de Tetraodon et prédictions ab initio). Parmi les 28 000 gènes annotés, certaines familles - sélénoprotéines, cytokines de type 1 et leurs récepteurs - ont fait l'objet d'un effort particulier. La comparaison du protéome de Tetraodon avec ceux des mammifères a fait apparaître certaines différences intéressantes, telles que la diversification plus importantes de certains systèmes hormonaux et des molécules de collagène chez les poissons.

La recherche des éléments transposables dans les séquences génomiques de Tetraodon a révélé une diversité importante (75 types) qui contraste avec leur rareté: la petite taille du génome de Tetraodon résulterait donc de la présence en petit nombre de ces éléments dont certains apparaissent encore actifs. Un autre facteur de compacité du génome de Tetraodon, confirmé par l'annotation, est la réduction de la taille des introns, qui les fait tendre vers une limite basse de 50-60 pb, et qui affecte préférentiellement certains gènes.

La disponibilité des séquences des génomes de l'homme et de la souris d'une part, de Takifugu et de Tetraodon d'autre part, offre des opportunités nouvelles pour l'étude de l'évolution des vertébrés. Nous avons montré que le taux d'évolution neutre est plus élevé chez les poissons que chez les mammifères. Les séquences protéiques des poissons divergeraient également plus vite que celles des mammifères. L'un des mécanismes de l'évolution est la duplication des gènes, que nous avons étudié en tirant parti de l'ancrage de la majorité des séquences de l'assemblage sur les chromosomes. Le résultat de cette étude témoigne fortement en faveur de l'hypothèse d'une duplication de l'ensemble du génome, survenue tôt dans la lignée des poissons à nageoires rayonnées (Actinoptérygiens). Cela est confirmé de façon encore plus nette par l'étude des relations de synténie entre les génomes de l'homme et de Tetraodon. Grâce à une carte de synténie à haute résolution, nous avons reconstitué le génome du vertébré ancestral antérieur à la duplication, dernier ancêtre commun à l'ensemble des vertébrés osseux. De ce caryotype ancestral, constitué de 12 chromosomes, on passe au génome de Tetraodon par un petit nombre de réarrangements interchromosomiques, tandis que les échanges entre chromosomes auraient été beaucoup plus nombreux dans la lignée conduisant à l'être humain. Tous ces résultats sont présentés dans un article paru dans le numéro du 21 octobre 2004 de la revue Nature.

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Ecologie et position systématique de Tetraodon nigroviridis
Tetraodon nigroviridis est un petit poisson (moins d'une dizaine de centimètres en captivité) prisé des aquariophiles. Dans la nature, on le trouve dans les cours d'eau d'Asie du Sud-Est (Indonésie, Indochine, Malaisie, Philippines), mais aussi dans les estuaires et les mangroves, et même occasionnellement en mer : il n'est donc pas strictement inféodé à l'eau douce. Tetraodon nigroviridis appartient à la famille des poissons-ballons "lisses" (Tetraodontidés), elle-même comprise dans l'ordre des Tetraodontiformes, qui inclut aussi les diodons (poissons-ballons "épineux"), les poissons-lunes, les poissons-coffres et les balistes. Tetraodon nigroviridis est souvent confondu avec une espèce très proche, Tetraodon fluviatilis. Le Genoscope a recherché des marqueurs moléculaires capables de différencier les deux espèces (accès à ces données et aux résultats phylogénétiques). D'autres membres de la famille des Tetraodontidés sont les fugus, poissons marins dont une espèce (Takifugu rubripes) a fait elle aussi l'objet d'un projet de séquençage (voir plus bas). Les lignées de Tetraodon nigroviridis et Takifugu rubripes ont divergé il y a 18 à 30 millions d'années.

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Les poissons-ballons, vertébrés au génome compact
L'intérêt pour les Tetraodontidés a été suscité en 1968, lorsque R. Hinegardner a révélé la très petite taille de leurs génomes ; en particulier, cet auteur a montré que le génome de Tetraodon, avec une taille grossièrement estimée à 380 Mb (mesure du contenu en ADN des cellules), était le plus petit des 300 génomes de poissons téléostéens mesurés, et, par conséquent, le plus petit génome de vertébré connu. En guise de comparaison, le poisson-zèbre (Danio rerio), aujourd'hui utilisé comme organisme modèle en génomique et en génétique, possède un génome de 1,6 milliard de paires de bases, quatre fois plus grand. Quant à l'être humain, son génome de 3,2 milliards de paires de bases est huit fois plus grand que celui de Tetraodon. Par la suite, Sydney Brenner et ses collègues à Cambridge ont confirmé la petite taille du génome d'un autre poisson-ballon, le fugu Takifugu rubripes: par une approche de séquençage aléatoire partiel, ils ont estimé sa taille à 400 Mb environ. Ces premières données de séquence ont par ailleurs confirmé l'hypothèse de la compacité du génome des poissons-ballons: comme l'on retrouve chez les poissons téléostéens la plupart des fonctions présentes chez les autres vertébrés, il était raisonnable de supposer que poissons et mammifères possèdent un répertoire à peu près comparable de gènes. On s'attendait donc à ce que la petite taille du génome des poissons-ballons soit due, non à une forte réduction du nombre de gènes par rapport aux mammifères, mais à une réduction des séquences non-codantes. Les premières séquences obtenues par Brenner en ont apporté la confirmation: elles ont révélé la petite taille des introns et des régions intergéniques du fugu, résultant de la rareté des séquences répétées. C'est en ce sens que ce génome dense en exons est dit "compact". La structure des gènes, quant à elle, apparaissait conservée: dans les quelques cas étudiés, les introns étaient retrouvés en des positions similaires dans un gène de Takifugu et dans le gène orthologue chez l'homme. Une analyse préliminaire du génome de Tetraodon nigroviridis, publiée en 2000, a révélé la même rareté des séquences répétées.

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Hypothèses au sujet des génomes compacts
Comment expliquer cette compacité des génomes des poissons-ballons ? L'analyse des séquences génomiques partielles de Tetraodon nigroviridis et Takifugu rubripes a apporté quelques éléments de réponse. Les éléments transposables, qui constituent la majorité des séquences répétées, représentent 45% de la séquence du génome humain, alors qu'ils sont très peu abondants chez les poissons-ballons: ils représentent 3,8% de l'assemblage de la séquence génomique de Tetraodon nigroviridis, et 2,7% de l'assemblage du fugu. Ce sont les plus faibles valeurs connues parmi les eucaryotes multicellulaires, même si l'abondance réelle des éléments transposables chez les deux poissons est sans doute un peu plus élevée: ils apparaissent en effet concentrés dans les régions hétérochromatiques du génome de Tetraodon (Dasilva et al., 2002), qui sont sous-représentées dans l'assemblage. S'ils sont rares, les éléments transposables présentent toutefois une diversité importante chez Tetraodon. Il est possible que les éléments transposables et les autres séquences sans contrainte fonctionnelle aient un taux de délétion plus élevé chez ces poissons, ce que semble confirmer le fait que les pseudogènes soient éliminés plus rapidement chez Tetraodon que chez l'homme. Un autre facteur à l'origine des génomes compacts des Tetraodontidés serait une résistance aux grandes insertions propre à cette lignée, comme semble l'indiquer une étude comparative avec des diodons et un poisson-lune (Neafsey et Palumbi, 2003). La taille des génomes des poissons-ballons pourrait avoir crû moins vite que dans les autres lignées de Tétraodontiformes, ou, comme cela semble plus probable, avoir subi une réduction au cours de l'évolution. Ces animaux constituent en tous cas un excellent modèle pour la compréhension des facteurs qui déterminent l'évolution de la taille des génomes.

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Le génome compact de Tetraodon nigroviridis, modèle pour l'étude génomique des vertébrés
Sydney Brenner fut le premier à formuler l'intérêt d'un génome compact comme celui de Takifugu pour l'étude des autres génomes de vertébrés. Il proposa dès 1993 de séquencer tout ou partie du génome du fugu pour accéder à moindre coût au répertoire des gènes des vertébrés. En séquençant une quantité d'ADN donnée chez un poisson-ballon, on a en effet bien plus de chances de trouver un exon qu'en séquençant la même quantité d'ADN chez un autre vertébré, en particulier chez un mammifère comme l'homme. Un séquençage à une profondeur modeste suffit donc pour avoir un premier aperçu du contenu en gènes d'un génome compact. Qui plus est, la rareté des séquences répétées permet d'envisager la réussite d'une stratégie de séquençage aléatoire global, rapide et économique, mais inadaptée à un génome aussi vaste et complexe que le génome humain.
Malgré ces arguments, le projet fugu n'a pu être mis en oeuvre immédiatement. En 1997, il n'était toujours pas financé et sa réalisation semblait peu probable. Le Genoscope a alors décidé d'entreprendre le séquençage d'un autre poisson à génome compact afin de disposer d'un "génome modèle" de vertébré. Le choix s'est porté sur Tetraodon nigroviridis, car ce petit poisson présente l'avantage d'être aisé à maintenir dans un aquarium d'eau douce et d'une acquisition facile dans les circuits aquariophiles, alors que Takifugu rupripes, pêché dans les eaux côtières de l'archipel nippon et de la Chine, est plus difficile à importer. Il faudrait en outre de grands bacs d'eau de mer pour maintenir ce fugu qui peut atteindre plusieurs kilogrammes. Tetraodon nigroviridis est donc plus adapté à des analyses moléculaires pour lesquels le matériel biologique doit être d'accès simple et constant (Crnogorac-Jurcevic et al., 1997).
En 2000, suite aux premières publications du Genoscope sur les séquences génomiques de Tetraodon, l'impact du séquençage d'un génome compact sur l'analyse du génome humain était démontré. C'est à cette époque que le projet de séquençage de Takifugu rubripes a démarré. Il a abouti en 2002 à la publication d'une ébauche de la séquence du génome (45 000 contigs assemblés en plus de 12 000 échaffaudages couvrant 332,5 Mb, pour une taille totale du génome estimée à 365 Mb) (Aparicio et al., 2002). La comparaison des protéines prédites dans la séquence du fugu avec les protéines humaines a livré des correspondances fortes pour trois quarts de ces dernières, ce qui valide l'hypothèse initiale d'un répertoire comparable de gènes chez tous les vertébrés.
Les projets Tetraodon et fugu sont moins redondants qu'ils le paraissent. La comparaison des séquences génomiques de deux poissons-ballons distants de 18 à 30 millions d'années permet d'améliorer l'annotation de part et d'autre, ce qui renforce l'utilité de ces génomes modèles.

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Exofish, un outil de génomique comparative
Toutefois, l'objectif principal du séquençage du génome de Tetraodon, au début du projet, était de pouvoir comparer sa séquence avec celle du génome humain afin d'y faciliter l'identification des gènes. Cette approche de génomique comparative est fondée sur une hypothèse simple: au cours des 400 millions d'années écoulées depuis la séparation des lignées de Tetraodon et de l'être humain, les régions du génome contraintes par leur fonction - en premier lieu les séquences codantes - ont accumulé moins de mutations, et ont donc divergé moins vite que les autres. La distance évolutive qui nous sépare de ce poisson est suffisamment grande pour que les séquences des introns et des régions intergéniques aient complètement divergé, mais elle reste assez faible pour que la majorité des séquences codantes aient été conservées sur au moins une partie de leur longueur. Ce contraste permet donc de les identifier par des comparaisons à l'échelle du génome entier (un usage du génome différent de celui retenu plusieurs années après dans le projet Takifugu, où la comparaison homme-poisson a été limitée aux gènes prédits).
Le Genoscope a développé à cette fin un outil de génomique comparative nommé Exofish (pour EXOn FInding by Sequence Homology), fondé sur l'algorithme BLAST (A propos d'Exofish). La comparaison par Exofish entre les séquences génomiques du poisson et la séquence du génome humain prise pour cible livre des Ecores (Evolutionary COnserved REgions), alignements des séquences de Tetraodon au niveau de régions conservées dans le génome humain. Un calibrage permet de définir les paramètres pour optimiser la spécificité (conditions telles qu'aucune ecore ne soit obtenue dans les introns de gènes humains connus) sans nuire à la sensibilité (fraction d'exons humains détectés).

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Une estimation du nombre des gènes humains par Exofish
Exofish a été utilisé pour la première fois en 2000, alors que seuls 33% de la séquence génomique de Tetraodon et 42% de la séquence du génome humain avaient été déterminés. Le but de cette comparaison était d'évaluer le nombre des gènes humains, pour lequel des valeurs très différentes étaient alors avancées. Le principe de l'évaluation était simple: le nombre d'ecores obtenues sur la séquence partielle du génome humain a été extrapolé à l'ensemble du génome, puis divisé par le nombre moyen d'ecores par gène (mesuré sur un jeu de gènes humains de référence). Ce calcul a permis d'estimer que le génome humain contient 28 000 à 34 000 gènes (voir le communiqué de presse). Ce résultat, publié en 2000 (Roest Crollius et al., 2000), s'accordait avec celui d'une étude parue en même temps, et qui reposait sur un principe différent (B. Ewing & P. Green, 2000). En revanche, il était très inférieur aux estimations qui avaient alors cours: on supposait depuis longtemps l'existence de 50 000 à 90 000 gènes humains, et certains prétendaient même que notre génome contenait plus de 200 000 gènes! Cette révision à la baisse a surpris, car elle accordait à l'être humain à peine plus du double du nombre des gènes de la drosophile. Depuis l'achèvement du séquençage du génome humain en avril 2003, elle a été confortée par les progrès de l'annotation : des procédures d'annotation automatiques telles que Ensembl, Twinscan ou SGP2 identifient entre 22 000 et 43 000 gènes humains.
Courant 2003, le Genoscope a profité de la disponibilité d'une séquence complète à 99% du génome humain, et d'un assemblage couvrant 90% de la séquence génomique de Tetraodon (voir plus bas), pour procéder à une nouvelle évaluation du nombre de gènes humains par Exofish. Le nombre moyen d'ecores par gène est cette fois mesuré à partir des ecores obtenues sur cinq chromosomes humains "finis" (les chromosomes 6, 13, 14, 20 et 22), dont l'annotation a été validée par des experts humains. Du nombre d'ecores obtenues sur l'ensemble de la séquence du génome humain est alors déduite une première valeur du nombre total de gènes, corrigée pour la fractions des ecores qui détectent des pseudogènes. Ce calcul aboutit à une fourchette de 22 500 à 29 500 gènes humains, en bon accord avec les résultats d'annotation indiqués plus haut (Jaillon et al., 2004).

Comparaison du gène humain SPAG7, codant une protéine du sperme, et du gène orthologue chez Tetraodon nigroviridis. Le gène du poisson est environ huit fois plus petit, mais possède la même structure en exons. La différence de taille réside au niveau des introns, et notamment du premier, qui mesure 6867 pb chez l'homme et 628 pb chez le poisson. La réduction des séquences intergéniques contribue également au génome compact de Tetraodon.

Les ecores obtenues par la comparaison homme-Tetraodon (accessibles sur le navigateur Comparative Genoscope) ont été utilisées dans la procédure d'annotation de plusieurs chromosomes humains publiés à ce jour (début 2004). Malgré ces efforts, près de 15 000 ecores étaient encore retrouvées, au printemps 2004, en dehors de toute annotation (gène ou pseudogène) sur la séquence du génome humain. Elles ont servi à définir 904 nouveaux modèles de gènes humains, à la lumière des modèles de gènes correspondant à ces ecores chez Tetraodon. Ces nouveaux gènes putatifs, dont la petite taille explique qu'ils n'aient pas été détectés, sont confirmés à plus de 60% par des données d'expression.

En comparant par Exofish les séquences génomiques de Tetraodon avec celles d'autres mammifères tels que le rat et la souris, on retrouve les ecores détectées dans le génome humain. Inversement, les ecores issues de la comparaison des génomes de l'homme, de la souris et de Takifugu avec celui de Tetraodon ont servi à l'identification des gènes du petit poisson (voir la procédure d'annotation dans la page "Projet de séquençage").

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Historique du projet de séquençage
Le projet de séquençage de Tetraodon nigroviridis a démarré fin 1997 au Genoscope. Il s'agit donc d'un projet propre qui a été défini et mis en oeuvre dès la mise en route du centre. A cette époque, le seul génome de vertébré dont la séquence complète était attendue était le génome humain: le projet de séquençage du génome de la souris n'a été lancé qu'en 1999, et le projet de séquençage de Takifugu rubripes a démarré fin 2000. Le choix de séquencer le génome de Tetraodon nigroviridis, un poisson à génome compact plus commode à maintenir en captivité que Takifugu, était donc initialement motivé par l'obtention rapide d'un outil de génomique comparative pour l'exploration du génome humain. Les données de séquence produites dans cette première phase de séquençage aléatoire global (0,3 équivalent génomique) ont pu ainsi être utilisées avec succès, début 2000, dans une comparaison à grande échelle avec la séquence du génome humain qui a indiqué l'existence d'environ 30 000 gènes humains (voir la partie précédente). Parallèlement à cette approche de séquençage aléatoire, des régions présentant un intérêt particulier (gènes du système immunitaire) ont été intégralement séquencées au Genoscope après sélection des inserts génomiques correspondants dans des clones BAC.
Le projet s'est ensuite orienté vers la production d'une séquence aussi complète que possible du génome de Tetraodon, en poursuivant le séquençage aléatoire global jusqu'à une profondeur élevée. Les nouveaux objectifs - l'analyse détaillée du protéome de Tetraodon, de l'organisation de son génome et des régions synténiques avec les autres génomes de vertébrés - requerraient en effet un assemblage de bonne qualité. En juin 2001, le Genoscope a été rejoint par le Whitehead Institute Center for Genome Research (aujourd'hui Broad Institute of MIT and Harvard). Près de la moitié des lectures ont alors été prises en charge par ce centre, ce qui a permis d'accélérer considérablement le projet. A la fin de l'année 2001 avaient ainsi été produits 6 équivalents génome (2,3 Gb de séquence brute), à parts égales par chaque centre (lire le communiqué de presse). Cette quantité de séquence était suffisante pour un premier essai d'assemblage au Genoscope (70% du génome couverts par une centaine de milliers de contigs). Deux équivalents génome supplémentaires ont alors été produits par le Genoscope.
Au final, ce sont 8,3 équivalents génome qui ont été produits et assemblés en 2002. L'ébauche résultante (près de 50 000 contigs reliés en plus de 25 000 supercontigs, ou échafaudages) couvre 90% des régions euchromatiques de Tetraodon et présente une meilleure contiguïté à grande échelle que l'ébauche génomique de Takifugu. Grâce à l'utilisation de données de cartographie physique, 39 "ultracontigs", représentent 64% de la séquence assemblée, ont pu être ancrés sur les 21 chromosomes de Tetraodon (voir leur répartition sur le caryotype). C'est la première fois que l'on dispose d'une vue d'ensemble de l'organisation d'un génome de poisson à l'échelle chromosomique. L'annotation de la séquence de l'ébauche, menée au Genoscope, a livré 27 918 modèles de gènes. Pour plus de détails sur l'assemblage et l'annotation, on se reportera à la page projet de séquençage, ainsi qu'à l'article paru en octobre 2004 dans la revue Nature(Jaillon et al.,2004).

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Paysage génomique de Tetraodon
L'un des premiers enseignements de l'ébauche de la séquence génomique de Tetraodon a été la confirmation de la petite taille de ce génome. Les 26 000 échafaudages qui forment l'assemblage couvrent 342 Mb (trous compris). Les 312 Mb de séquence qu'ils contiennent représentent 90% de l'euchromatine de Tetraodon (pourcentage mesuré avec un jeu de lectures aléatoires), laquelle peut donc être évaluée à 346 Mb.

Répartition globale des gènes dupliqués dans les 21 chromosomes de Tetraodon. Les lignes courbes joignent deux gènes issus d'une duplication. Les gènes présents sur un meme segment chromosomique ont tendance à posséder des copies dupliquées sur un seul autre chromosome. Cela est particulièrement net entre les chromosomes 9 et 11

Quant à la taille totale des 21 chromosomes qui constituent ce génome, elle a été estimée par cytométrie de flux dans une fourchette de 329 à 356 Mb. Les régions hétérochromatiques apparaissent donc limitées. Cette compaction extrême explique que le pourcentage en paires de bases G+C (GC%) du génome de Tetraodon soit plus élevé que ceux des grands génomes de mammifères. Cette grandeur est en effet corrélée positivement à la densité en gènes chez les vertébrés. Toutefois, la distribution du GC% présente la même forme en cloche asymétrique -  indicatrice d'une répartition non homogène des gènes  - que celles de l'homme et de la souris: elle est simplement décalée vers les valeurs les plus élevées. Chez Takifugu rubripes, en revanche, la distribution du GC% est homogène. Cette différence frappante entre les génomes de deux espèces aussi proches s'explique peut être par un défaut de séquençage ou d'assemblage d'une fraction riche en (G+C) du génome de Takifugu.

La séquence génomique a aussi permis d'étudier en détail la diversité et l'abondance des éléments transposables chez Tetraodon. Comme attendu, ils sont rares dans ce génome compact: environ 4 000 copies détectées dans les séquences non assemblées, soit au moins 3,8% du génome. Toutefois, ils sont aussi très divers: 75 séquences consensus (voir Tableau 3) ont pu être reconstituées (53 éléments de classe I et 22 éléments de classe II représentant une grande variété de familles), alors qu'une vingtaine de types seulement ont pu être définis à partir des millions de copies présentes dans les génomes de l'homme et de la souris. Certaines familles semblent encore actives. Pour expliquer la rareté record des éléments transposables chez Tetraodon, il faut donc supposer qu'ils subissent un taux de délétion particulièrement élevé. Les éléments transposables se concentrent dans des régions hétérochromatiques, en particulier les bras courts de petits chromosomes. Dans les régions euchromatiques, on constate une présence préférentielle des SINE (short interspersed elements) dans les régions riches en (A+T), et des LINE (long interspersed elements) dans les régions riches en (G+C), soit l'inverse de ce que l'on observe chez les mammifères.

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Répertoire des gènes de Tetraodon
L'annotation de la séquence génomique de Tetraodon a permis de définir 27 918 modèles de gènes codant des protéines. Ce nombre est du même ordre que celui des gènes humains. A une échelle très globale, les résultats de l'analyse Exofish (voir plus haut) confirment ce résultat. Nous avons comparé les séquences génomiques de quatre vertébrés (Takifugu, Tetraodon, souris et humain) - chacune étant prise à tour de rôle comme séquence cible -, et obtenu pour les quatre génomes un nombre similaire de régions conservées au cours de l'évolution (ecores). Or ces ecores peuvent correspondre aussi bien à des gènes qu'à des pseudogènes, et l'on sait que ces derniers sont beaucoup moins abondants chez Tetraodon et Takifugu que chez les mammifères. Cela implique donc que les poissons possèdent légèrement plus de gènes effectivement codants que les mammifères.

Les gènes représentent 40% du génome de Tetraodon. On trouve 6,9 exons codants par gène en moyenne, et la distribution de la taille des exons est similaire à celle que l'on observe chez l'homme. En revanche, la distribution de la taille des introns est nettement différente. La limite inférieure de taille des introns est la même chez les deux vertébrés (entre 50 et 60 pb), mais on trouve beaucoup plus d'introns approchant cette limite chez Tetraodon que chez l?homme. Ce phénomène ne concerne toutefois qu'une sous-population de gènes de Tetraodon. Il reste à comprendre pourquoi certains gènes ont subi cette évolution vers la réduction de leurs introns, alors que d'autres ne semblent pas affectés.
Un effort particulier a été consenti pour des gènes posant des problèmes d'annotation (voir la page "Projet de séquençage"). C'est notamment le cas des gènes codant les cytokines de type I et leurs récepteurs, dont les séquences sont peu conservées parmi les vertébrés. Aucun n'avait été retrouvé dans le génome de Takifugu, et l'on pouvait dès lors se demander si cette grande famille de gènes, qui inclut des hormones et des interleukines, est absente chez les poissons. Dans le génome de Tetraodon, au contraire, nous avons découvert 39 gènes qui appartiennent à toutes les familles trouvées chez les mammifères. La comparaison avec ces derniers indique que, depuis le dernier ancêtre commun à Tetraodon et aux mammifères, la diversification a surtout opéré sur les systèmes hormonaux (hormones de croissance et prolactine) dans la lignée des Actinoptérygiens (poissons à nageoires rayonnées), tandis qu'elle concernait davantage les interleukines dans la lignée des mammifères.
La comparaison globale entre le protéome de Tetraodon et ceux des autres vertébrés séquencés (Takifugu, humain, souris) ainsi que de l'ascidie Ciona intestinalis (invertébré cordé) procure quelques enseignements. L'analyse des domaines protéiques par InterPro révèle peu de différences entre poissons et mammifères. On note toutefois que:

• les molécules de collagène sont bien plus diverses chez les poissons que chez les mammifères.
• certains domaines associés au transport du sodium sont davantage présents chez les deux poissons et chez Ciona, ce qui reflète sans doute le fait qu'ils vivent en eau salée.
• les nucléosidases spécifiques des purines sont elles aussi plus abondantes chez les poissons.
• les répresseurs transcriptionnels à boîte KRAB, dont on trouve plusieurs centaines chez les mammifères, sont totalement absents chez les poissons.

Si l'on considère à présent les classifications dans "Gene Ontology" pour comparer les fréquences des diverses catégories fonctionnelles, on constate de nouveau peu de différences. Les deux poissons et Ciona ont tendance à différer ensemble des mammifères; ils présentent une plus grande fréquence des fonctions enzymatiques et de transport, et une plus faible fréquence des protéines impliquées dans la transduction du signal et des protéines structurales.

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Aspects évolutifs (1): taux d'évolution neutre et taux d'évolution de l'ADN codant
La disponibilité des séquences des génomes de l'homme et de la souris d'une part, de Takifugu et de Tetraodon d'autre part, offre des opportunités nouvelles pour l'étude de l'évolution des vertébrés. Nous nous sommes intéressés en premier lieu à la vitesse avec laquelle ces séquences ont divergé au cours de l'évolution, au niveau de l'ADN sans contrainte fonctionnelle.

Pour étudier le taux d'évolution neutre entre deux lignées de vertébrés aussi distantes que les poissons téléostéens et les mammifères, il n'était pas possible d'identifier des séquences répétées ancestrales, comme entre l'homme et la souris. Aussi avons nous examiné les positions libres de muter au sein des gènes hérités en commun par les quatre espèces. La première étape a donc consisté à définir un ensemble de 5 802 quadruplets de gènes orthologues. Nous avons ensuite étudié, au sein de ces orthologues, les troisièmes positions de certains codons, dites "quatre fois dégénérées", car elles peuvent être substituées par n'importe lequel des quatre nucléotides sans que cela change la nature de l'acide aminé codé. Cette étude a confirmé le taux d'évolution neutre mesuré précédemment sur un plus petit nombre d'orthologues entre l'homme et la souris; elle a en outre révélé que le taux d'évolution neutre entre les deux poissons est 2,5 fois plus élevé qu'entre les deux mammifères.

Nous nous sommes ensuite intéressés au taux de divergence des séquences protéiques, en comparant les séquences du même ensemble d'orthologues. La similarité moyenne est moins grande entre les protéines orthologues de Takifugu et de Tetraodon qu'entre les protéines de l'homme et de la souris; or les lignées des deux poissons se sont séparées depuis moins longtemps que celles des deux mammifères. Les séquences protéiques divergeraient donc plus vite chez les poissons, comme cela avait déjà été observé à partir d'un petit nombre de gènes. La comparaison avec un proche parent des vertébrés - l'ascidie Ciona intestinalis - confirme ce résultat: la fréquence des mutations qui substituent un acide aminé par un autre (Ka) est en moyenne plus élevée entre Ciona et Tetraodon qu'entre Ciona et l'homme. En outre, le rapport entre substitutions non synonymes (Ka) et substitutions synonymes (Ks) est lui aussi plus élevé entre les deux poissons qu'entre les deux mammifères. Depuis le dernier ancêtre commun aux poissons-ballons et aux mammifères, l'évolution se serait donc accélérée dans la lignée des premiers, ou bien ralentie dans la lignée des seconds.

Modèle pour le passage du caryotype du dernier ancêtre commun des vertébrés osseux (12 chromosomes ancestraux) à ceux de l'homme et de Tetraodon

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Aspects évolutifs (2): duplication du génome
Des études récentes ont accrédité l'hypothèse d'une duplication de l'ensemble du génome propre à la lignée des poissons à nageoires rayonnées. Une telle duplication, suivie d'une perte massive de gènes, a déjà été démontrée chez les levures. Il pourrait s'agir d'un mécanisme très important dans l'évolution des génomes eucaryotes. Nous avons donc recherché la trace d'un tel événement dans le génome de Tetraodon. La séquence génomique de Tetraodon présente un avantage unique pour une telle recherche: il s'agit du premier génome de poisson pour lequel on dispose d'un assemblage en grande partie ancré sur les chromosomes. Pour la première fois, on peut donc étudier la distribution des gènes dupliqués à une échelle globale, dans le but de trancher entre l'hypothèse d'un passage soudain à l'état tétraploïde et celle d'une série d'événements de duplication discrets.

Nous avons ainsi identifié plus de 1 000 paires de gènes dupliqués chez Tetraodon, et près de 1 000 chez Takifugu. Près de 75% des événements de duplication apparaissent antérieurs à la séparation des lignées de Takifugu et de Tetraodon. La distribution de ces anciens gènes dupliqués est frappante: les copies des gènes présents sur un même segment chromosomique sont presque toutes présentes sur un seul autre chromosome, et cette organisation est retrouvée sur l'ensemble des chromosomes. La façon la plus simple de l'expliquer est de supposer la duplication de tout le génome en un seul événement. La conservation d'une telle organisation tétraploïde au cours des centaines de millions d'années écoulées depuis la duplication serait due à la forte densité en gènes du génome de Tetraodon: les réarrangements chromosomiques y seraient plus fréquemment défavorables que chez les mammifères, car ils interféreraient plus fréquemment avec l'expression des gènes.

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Aspects évolutifs (3): synténie entre les génomes de Tetraodon et des mammifères
L'étude de la distribution des gènes orthologues entre le génome de Tetraodon et ceux de l'homme et de la souris a apporté la démonstration définitive de la duplication ancestrale du génome, et clot ainsi la controverse à ce sujet. Là encore, l'ancrage d'une grande part de la séquence de Tetraodon sur les chromosomes a constitué un avantage majeur: il a permis de réaliser la première carte de synténie à haute résolution entre poissons et mammifères. A partir de 6 684 gènes de Tetraodon de position chromosomique connue qui possèdent un orthologue dans le génome humain, nous avons défini 900 groupes de synténie (groupe d'au moins deux gènes contigus dont les orthologues sont situés sur un même chromosome humain). De même, 6 831 gènes orthologues avec un gène de souris ont été organisés en 1 014 groupes de synténie. Le fait que les groupes de synténie soient plus nombreux avec la souris qu'avec l'homme confirme la plus grande fréquence des réarrangements chromosomiques chez les rongeurs.

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Aspects évolutifs (4): le génome du vertébré ancestral
Nous avons tiré parti de cette synténie pour reconstituer l'organisation ancestrale du génome, au moment de la divergence de la lignée des poissons à nageoires rayonnées. Après la duplication de ce génome ancestral, les copies surnuméraires des gènes ont du être perdues indifféremment sur l'un ou l'autre des chromosomes de chaque paire issue de la duplication. On s'attend donc à ce que les gènes de chaque chromosome ancestral soient retrouvés sur deux chromosomes. L'étude des relations de synténie avec le génome humain confirme effectivement cette distribution binaire: les orthologues des gènes d'une même région chromosomique chez l'homme sont bien retrouvés pour la plupart sur deux chromosomes différents de Tetraodon. Il s'agit d'une démonstration indépendante de la duplication du génome entier, mais aussi d'un moyen bien plus puissant que l'étude des gènes dupliqués pour délimiter les segments chromosomiques dupliqués, et reconstituer les événements de fusion et de fragmentation. Nous proposons ainsi l'existence de 12 chromosomes dans le génome ancestral. Ce résultat est en accord avec la valeur modale du nombre haploïde de chromosomes dans les génomes des Téléostéens actuels, qui est de 24. Les 24 chromosomes issus de la duplication dans la lignée des Téléostéens auraient subi 5 fusions, 3 translocations et 2 fragmentations pour donner les 21 chromosomes du génome de Tetraodon.

Dans la lignée conduisant à l'homme, en revanche, les réarrangements interchromosomiques entre les 12 chromosomes ancestraux ont été plus nombreux. Cela reflète l'augmentation considérable du nombre de séquences répétées dans cette lignée. Dans les génomes ainsi "dilatés" et moins denses en gènes, les réarrangements ont pu survenir avec des conséquences moins délétères. L'on peut en outre évaluer l'ancienneté relative de ces événements: les gènes présents sur deux blocs ancestraux anciennement fusionnés auront été brassés et répartis de façon homogène sur toute la longueur du nouveau chromosome par des réarrangements intrachromosomiques; en revanche, les gènes de blocs récemment fusionnés apparaitront plus nettement ségrégés. On retrouve ainsi, par exemple, la fusion récente qui a abouti au chromosome 2 humain, à partir de deux chromosomes restés distincts chez le chimpanzé. Le séquençage prochain d'autres génomes, ceux d'autres vertébrés ou de l'amphioxus, plus proche parent actuel des vertébrés, permettra d'éclaircir davantage l'histoire de cette mosaïque chromosomique.

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Le séquençage du génome de Tetraodon nigroviridis est un projet propre du Genoscope. En 2001, le Whitehead Institute Centre for Genome Research (WICGR), aujourd'hui Broad Institute of MIT and Harvard s'est joint au projet et a produit un peu moins de la moitié des lectures. L'étape d'assemblage a également été conduite en collaboration avec le WICGR. Plusieurs autres groupes ont collaboré à l'analyse et à l'annotation de la séquence génomique de Tetraodon nigroviridis :

• Laboratoire de Biologie Moléculaire de la Cellule, CNRS UMR 5161, INRA UMR 1237, Ecole Normale Supérieure de Lyon ;
• Service de Systématique Moléculaire, CNRS IFR 101, dans le Département Systématique et Evolution du Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris ;
• Défenses Antivirales et Antitumorales, CNRS UMR 5124, Montpellier ;
• Grup de Recerca d'Informàtica Biomèdica, IMIM-UPF et Programa de Bioinformàtica i Genòmica à Barcelone ;
• Biométrie et Biologie Evolutive, CNRS UMR 5558, Université Lyon 1 ;
• Laboratoire des Interactions Plantes-Microorganismes, INRA UMR 441, CNRS UMR 2594, Toulouse ;
• Agencourt, Massachusetts, Etats-Unis ;
• Groupe "Evolutionary Fish Genomics", Biozentrum, Université de Würzburg, Allemagne.

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Bibliographie

• R. Hinegardner, Am. Nat. (1968) 102, 517-563.
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• T. Crnogorac-Jurcevic et al., Genomics (1997) 41, 177-184.
• B. Ewing & P. Green, Nature Genet. (2000) 25, 232-234.
• S. Aparicio et al., Science (2002) 297, 1301-1310.
• K.L. Howe et al., Genome Res. (2002) 12, 1418-1427.
• D.E. Neafsey et S.R. Palumbi, Genome Res. (2003) 13, 821-830.

Les articles sur Tetraodon issus des travaux du Genoscope et de ses collaborateurs

• H. Roest Crollius et al., Characterization and repeat analysis of the compact genome of the freshwater pufferfish Tetraodon nigroviridis. Genome Res. (2000) 10, 939-949.
• H. Roest Crollius et al., Human gene number estimate provided by genome wide analysis using Tetradon nigroviridis genomic DNA, Nature Genet. (2000) 25, 235-238.
• C. Dasilva et al., Remarkable compartimentalization of transposable elements and pseudogenes in the heterochromatine of the Tetraodon nigroviridis genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99, 13636-13641.
• F. Grützner et al., Four-hundred million years of conserved synteny of human Xp and Xq genes on three Tetraodon chromosomes. Genome Res. (2002) 12, 1316-1322.
• L. Bouneau et al., An active non-LTR retrotransposon with tandem structure in the compact genome of the pufferfish Tetraodon nigroviridis. Genome Res. (2003) 13, 1686-95.
• G. Lutfalla et al., Comparative genomic analysis reveals independant expansion of a lineage-specific gene family in vertebrates: the class II cytokine receptors and their ligands in mammals and fish. BMC Genomics (2003) 4, 29.
• J.N. Volff et al., Diversity of retrotransposable elements in compact pufferfish genomes. Trends Genet. (2003) 19, 674-678.
• O. Jaillon et al., Genome duplication in the teleost fish Tetraodon nigroviridis reveals the early vertebrate proto-karyotype. Nature (2004) 431, 946-957.