Collection de mutants

Principe et Méthode :

Chaque CDS (1), définie lors de l'annotation, a été remplacée par recombinaison homologue par une cassette contenant le gène de résistance à la kanamycine placé sous le contrôle d'un promoteur fort (promoteur du phage T5). Les extrémités de la cassette d'intégration, appelées "pieds de recombinaison", sont constituées de régions spécifiques qui encadrent le gène à muter. Le remplacement se fait en général sur la totalité de l'ORF (2). Cependant, pour éviter l'altération de régions essentielles telles que le RBS (3) ou le promoteur des gènes voisins du gène cible, nous avons été amenés à faire un remplacement en tronquant l'ORF cible de quelques acides aminés. La construction moléculaire des cassettes est obtenue in fine par une PCR (4) recombinante des pieds de recombinaison avec le gène de résistance à l'antibiotique. Après transformation d'Acinetobacter baylyi par chacune de ces cassettes, les mutants sont sélectionnés sur un milieu minéral supplémenté en succinate et en kanamycine.

Technique :

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La phase production :

L'optimisation du protocole de transformation ainsi que celle de l'organisation du " pipeline " nous a permis d'atteindre plus de 90% de réussite et une capacité de 400 mutants initiés toutes les deux semaines. Le cycle entier d'obtention d'un mutant depuis l'étape de transformation jusqu'à son stockage est de 4 semaines. Ce cycle inclut les PCR contrôles pour s'assurer du remplacement de l'ORF par la cassette d'intégration ainsi que le séquençage systématique des régions génomiques du mutant adjacentes à la cassette d'intégration.

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Résultats :

Sur les 3 205 gènes annotés chez A. baylyi et candidats à la mutation, nous avons tenté d'inactiver 3 061 gènes. Nous avons obtenu des mutants de remplacement pour 2 621 gènes, ce qui représente 77% des gènes d'A. baylyi. Pour 96% des knockouts, deux clones indépendants ont été obtenus.

Répartition des mutants obtenus selon la catégorie de fonction des gènes

Perspectives :

La phase systématique de remplacement des gènes, maintenant achevée, sera prolongée par une phase de finition ciblée, pour essayer d'obtenir les mutants pour lesquels la première tentative a échoué. Une simple répétition des expériences devrait suffire pour les "échecs techniques" avec, pour un certain nombre d'entre eux, le choix de nouvelles amorces dans des régions plus favorables. Nous allons également essayer de répéter les expériences sur milieu plus riche afin d'obtenir les mutants des gènes qui sont essentiels sur succinate.

Une phase analytique de la collection va être maintenant abordée en plus du phénotypage systématique afin d'étudier, par exemple, des gènes de fonction inconnue co-localisés avec des gènes participant à la même voie métabolique.

Glossaire :

(1) CDS : Coding DNA Sequence.
(2) ORF : Open Reading Frame.
(3) RBS : Ribosome Binding Sequence.
(4) PCR : Polymerase Chain Reaction.

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