1. Résumé du projet
Ce projet vise à mettre en place des approches génomiques et post-génomiques de la génétique du développement chez deux espèces qui occupent des positions phylogénétiques-clefs chez les vertébrés, la lamproie L. fluviatilis et la roussette S. canicula. Le but général de ce travail est de préciser les mécanismes moléculaires qui fondent l'unité de ce groupe ainsi que les variations qui rendent compte de sa diversification. Nous chercherons plus particulièrement :

• à résoudre les points qui restent indéterminés dans la phylogénie des chordés,
• à préciser la chronologie exacte et les mécanismes des duplications géniques qui sont intervenues chez les vertébrés ainsi que le mode d'évolution des familles multigéniques correspondantes et
• à comparer entre les grands groupes de vertébrés les réseaux génétiques qui contrôlent plusieurs processus développementaux.

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2. Résultats des équipes impliquées
Au cours des dernières années, nos travaux ont permis d'évaluer la possibilité d'utiliser la lamproie et la roussette pour des analyses comparatives des mécanismes génétiques qui contrôlent le développement embryonnaire et ont confirmé l'intérêt de ces espèces. Nos résultats concernent deux aspects principaux, l'évolution des familles multigéniques chez les vertébrés, analysée à travers l'étude de systèmes modèles, et l'évolution de plusieurs processus développementaux. Dans le premier cas, des analyses comparatives détaillées nous ont permis de préciser la composition et le mode d'évolution de plusieurs familles multigéniques modèles codant pour des facteurs de transcription à homéodomaine (Emx, Otx). Les résultats obtenus montrent que dans ces deux cas, la fixation des classes d'orthologie a précédé la radiation des gnathostomes. Les analyses comparées des profils d'expression soulignent le rôle essentiel mais non exclusif des signaux de régulation en -cis dans l'évolution fonctionnelle de ces familles et la complexité des processus mis en jeu, qui impliquent des réaffectations fonctionnelles (" function shuffling "), comme des recrutements vers des nouveaux territoires d'expression. L'étude d'une autre famille de gènes à homéodomaine (Evx) est également engagée chez la roussette, avec plusieurs séquences clonées chez cette espèce. Par ailleurs, nos travaux ont permis de montrer que l'étude des profils d'expression embryonnaire de gènes impliqués dans la régionalisation précoce du cerveau antérieur (Otx, Emx, Pax6, Pax3, Lhx1/5, Lhx2/9) permet de retrouver chez ces deux groupes la plupart des subdivisions neuromériques caractérisées chez les ostéichtyens. Des différences notables sont cependant également observées : ainsi, à la différence des vertébrés à mâchoires, Nkx2.1 n'est pas exprimé dans le télencéphale chez la lamproie. Nous avons également caractérisé chez la roussette les profils d'expression embryonnaire de plusieurs gènes qui jouent des rôles essentiels en cours de gastrulation chez les ostéichtyens (Fox-a2, Lim1, Otx , Brachyury) et ainsi fourni la première caractérisation moléculaire de la gastrulation chez un chondrichtyen. Ces premières analyses fournissent le fondement d'études beaucoup plus détaillées, actuellement en cours à l'aide de nouveaux marqueurs récemment amplifiés dans nos laboratoires.

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3. Projet de recherches
L'émergence des vertébrés a été marquée par l'apparition de très nombreuses innovations morphologiques et physiologiques (présence d'un crâne, d'un coeur cloisonné et des reins, apparition d'un cerveau élaboré présentant à l'état embryonnaire cinq subdivisions bien caractérisées et d'organes sensoriels pairs, individualisation au cours du développement de populations cellulaires qui présentent des propriétés de migration ou de différenciation complexes, comme les placodes ou les crêtes neurales). Ce groupe d'animaux est par ailleurs caractérisé par une très grande diversité morphologique, associée à des adaptations à des milieux et modes de vie très variés (apparition des mâchoires chez les gnathostomes, évolution de la structure de l'oreille interne des tétrapodes lors du passage à la vie terrestre, adaptations variées du membre chiridien). Les bases moléculaires de ces changements, à la transition entre prochordés et crâniates puis chez les vertébrés, restent cependant très mal comprises. Plusieurs auteurs ont avancé l'hypothèse d'un lien entre la complexification morphologique des vertébrés et l'expansion de leur génome par duplications géniques. Il est en effet aujourd'hui acquis que l'émergence des vertébrés est corrélée à l'expansion d'un très grand nombre de familles de gènes, présents à une copie unique chez les prochordés. Selon les scénarios classiques d'évolution de familles multigéniques (néo-fonctionnalisation), une duplication génique a pour effet le relâchement des contraintes de sélection s'exerçant sur l'une des copies, qui peut donc évoluer vers de nouvelles fonctions, correspondant par exemple à des innovations évolutives, l'autre conservant les fonctions ancestrales. Aucun exemple clair de ce mode d'évolution n'a cependant été décrit dans le contexte particulier de l'origine des vertébrés. En revanche, d'autres modèles, aux conséquences fonctionnelles très différentes, ont été proposés. Ainsi, comme le suggère l'étude de duplications géniques intervenues récemment chez les actinoptérygiens, le premier effet de ce type d'événement génétique pourrait être une répartition des fonctions ancestrales entre paralogues, ce qui n'implique aucune innovation fonctionnelle. Par ailleurs, de nombreux mécanismes moléculaires autres que les duplications géniques, tels que les modifications de territoires d'expression, l'acquisition de nouveaux domaines structuraux par des facteurs de transcription ou l'épissage alternatif des transcrits, peuvent conduire à des innovations morphologiques, comme l'ont démontré les études de plusieurs systèmes génétiques chez des modèles protostomiens.
L'étude des mécanismes génétiques du développement embryonnaire fournit actuellement une approche renouvelée de l'évolution des morphologies chez les métazoaires. Si les approches expérimentales directes qui peuvent être mises en oeuvre pour étudier des processus de micro-évolution sont inapplicables au problème de l'émergence et de la diversification des vertébrés, des analyses comparatives entre les grands groupes de ce phylum et les prochordés peuvent permettre de préciser les changements intervenus à des périodes charnières de leur évolution. Au cours des vingt dernières années, les analyses fonctionnelles du développement embryonnaire chez les organismes modèles vertébrés ont conduit à des progrès considérables dans la compréhension des mécanismes génétiques du développement chez les ostéichtyens. Ces données constituent une référence indispensable mais elles sont très insuffisantes dans une perspective comparative puisqu'elles excluent les deux autres grands autres groupes de vertébrés, les cyclostomes et les chondrichtyens. Notre projet vise à mettre en place les outils nécessaires à des caractérisations moléculaires du développement embryonnaire chez un cyclostome, la lamproie Lampetra fluviatilis, et un chondrichtyen, la roussette Scyliorhinus canicula, par des analyses du transcriptome chez ces deux espèces et la construction d'une banque de BACs chez la roussette. Cette stratégie devrait nous permettre d'atteindre trois objectifs principaux :

• résoudre de façon définitive les problèmes qui subsistent dans la phylogénie des chordés,
• caractériser les modes d'évolution des familles multigéniques fréquemment rencontrées dans les génomes des vertébrés à travers l'étude de systèmes modèles,
• préciser les réseaux génétiques qui contrôlent les processus développementaux étudiés par les équipes associées afin d'évaluer leur conservation et de mettre en évidence d'éventuelles variations, notamment celles qui peuvent être liées à des innovations morphologiques.

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4. Objectifs du projet

Phylogénie des chordés
Comprendre l'origine et la diversification des métazoaires implique d'établir de façon fiable les relations de parenté entre les différents phylums animaux. Dans le taxon des deutérostomiens, plusieurs noeuds très importants restent mal résolus, comme la monophylie des cyclostomes et les relations de parenté entre les chordés, céphalochordés et urochordés. Nous développons depuis plusieurs années une approche phylogénomique afin d'améliorer les inférences phylogénétiques. Les outils informatiques nécessaires ont été élaborés et validés au cours d'études précédentes de la position phylogénétique d'organismes tels qu'un choanoflagellé (Monosiga ovata) et une amibe (Mastigamoeba balamuth) en utilisant les séquences d'EST de ces organismes (Bapteste et al. 2002. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:1414-1419; Philippe et al., 2004. Mol Biol Evol. 21:1740-1752). Le séquençage d'ESTs de la lamproie (Lampetra fluviatilis) et du requin (Scyliorhinus canicula) permettra d'enrichir notre échantillonnage taxonomique de deux organismes clés pour lesquels peu de données sont actuellement disponibles (projet développé par D. Casane, en collaboration avec H. Philippe).

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Evolution des familles multigéniques chez les vertébrés
Chronologie et mécanisme des duplications géniques chez les vertébrés. L'hypothèse du rôle de duplications géniques dans l'émergence des vertébrés est très largement fondée sur des comparaisons entre ostéichtyens et céphalochordés et peu d'études sont disponibles chez les chondrichtyens et les cyclostomes. Quelques travaux indiquent cependant une bonne correspondance entre les classes de gènes orthologues identifiées chez les ostéichtyens et les chondrichtyens. En revanche, pour la plupart des systèmes génétiques étudiés, aucune relation claire ne se dégage entre les classes de gènes identifiées chez les gnathostomes et les gènes caractérisés chez les cyclostomes, généralement très divergents. S'il est clair que les duplications géniques observées chez les ostéichtyens ont eu lieu avant la radiation des gnathostomes et après la séparation entre céphalochordés et crâniates, la chronologie précise de ces événements est mal connue. Cette incertitude est principalement due au manque de données de séquences chez les cyclostomes et les chondrichtyens. Le mécanisme des duplications est aussi sujet à controverse, l'hypothèse couramment avancée de deux phases successives de polyploïdisation n'ayant pas encore été clairement démontrée. Une première partie du projet visera donc à préciser les relations phylogénétiques de nombreuses familles multigéniques des cyclostomes et des gnathostomes, en déterminant et en analysant des jeux de séquences beaucoup plus étendus que ceux qui sont actuellement disponibles (projet développé par D. Casane en collaboration avec H. Philippe).

Mode d'évolution de familles multigéniques modèles. Un deuxième aspect de cette étude visera à étudier le mode d'évolution de trois familles multigéniques modèles, les gènes Hox, Dlx et Evx, par une analyse comparative systématique des structures et profils d'expression embryonnaire chez un large spectre de vertébrés. Ces gènes ont été choisis pour trois raisons principales. Tout d'abord, les familles correspondantes, dont la composition est bien caractérisée chez les ostéichtyens (mammifères et poisson-zèbre) et les céphalochordés fournissent des exemples clairs de duplications chez les vertébrés. Les données sont cependant actuellement très incomplètes pour les cyclostomes et les chondrichtyens. Les séquences disponibles indiquent par ailleurs des variations importantes de vitesse d'évolution entre les différentes classes, dont la signification biologique est inconnue. Enfin, les comparaisons de profils d'expression embryonnaire entre cépholochordés et ostéichtyens suggèrent une complexification considérable des fonctions de ces gènes chez les vertébrés. Un grand nombre de ces fonctions concernent des processus morphogénétiques correspondant à des innovations intervenues chez certains groupes de vertébrés (parmi beaucoup d'autres, on peut citer le rôle des gènes Hox dans le développement des membres pairs, le rôle des gènes Evx dans la formation des dents pharyngiennes et des nageoires rayonnées, le rôle des gènes Dlx dans la formation de dérivés des placodes et des crêtes neurales). L'enjeu est donc ici de corréler de façon précise les duplications des gènes, les modifications de leurs territoires d'expression embryonnaire et les évènements morphogénétiques qui en dépendent (projet développé par D. Casane).

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Evolution de processus développementaux chez les vertébrés
Gastrulation. S'il est actuellement clair que le contrôle génétique de la gastrulation fait intervenir des réseaux conservés à très grande échelle évolutive, l'étendue précise des conservations dans les interactions génétiques et cellulaires est loin d'être établie même chez un groupe d'espèces relativement proches comme les vertébrés. Cette situation est liée à la divergence extensive des morphologies, les difficultés à comparer des approches fonctionnelles différentes mais également la complexité de l'évolution de certains systèmes génétiques, marquée par des duplications ou pertes de gènes, des accélérations de taux d'évolution dans certains taxons. Au cours de nos analyses précédentes, la petite roussette S. canicula s'est révélée un modèle de choix pour l'étude de l'évolution des mécanismes de gastrulation chez les vertébrés non seulement de par sa position phylogénétique charnière chez les gnathostomes mais également du fait d'une morphologie d'interprétation particulièrement simple et d'une ressemblance totalement inattendue avec les embryons de certains amniotes (reptiles, poulet). L'étude de cette espèce pourrait donc permettre de mieux comprendre la relation et les mécanismes de transition entre les modes de gastrulation mis en oeuvre chez les principales espèces modèles étudiées (Sauka-Spengler et al, 2003. Dev. Biol. 263, 296-307). Nous chercherons à étendre la caractérisation moléculaire de la gastrula chez la roussette afin de préciser d'éventuelles homologies de territoires en centrant l'étude sur les régions organisatrices mais également les tissus extraembryonnaires, qui chez les amniotes sont des sources de signaux sécrétés essentiels pour le développement de l'embryon. Nous utiliserons pour cela une approche de type transcriptome, éventuellement complétée par la technique de PCR dégénérée. Nous compléterons ces descriptions moléculaires par la mise en oeuvre d'approches fondées sur la transgenèse hétérologue. Il s'agira dans ce cas d'intégrer dans le génome murin des BACs de roussette, portant des gènes marqueurs de territoires bien définis chez cette espèce, et de tester leur profil d'expression dans le contexte murin. Le gène Otx5 de roussette fournit un système particulièrement intéressant pour cette approche. Il est en effet exprimé à des stades très précoces de la gastrulation au niveau de la marge postérieure du blastoderme, qui pourrait être homologue au croissant de Koller ou à la zone marginale postérieure du poulet (projet développé par S. Mazan et D. Casane).

Evolution du cerveau antérieur chez les vertébrés. Nous chercherons à mettre en oeuvre une approche descriptive, visant à comparer de façon systématique les mécanismes génétiques impliqués dans la spécification précoce et la régionalisation du cerveau antérieur chez les cyclostomes et les chondrichtyens. Les études moléculaires suggèrent que certaines grandes subdivisions du système nerveux central, notamment le long de l'axe antéro-postérieur, sont vraisemblablement conservées chez l'ensemble des chordés. Toutefois, le cerveau, et en particulier le cerveau antérieur, présente une complexification et une diversification considérable, à la fois morphologique et fonctionnelle, chez les vertébrés. Les résultats obtenus jusqu'ici, essentiellement chez les ostéichtyens, suggèrent une bonne conservation de la spécification régionale précoce. Elle s'accompagne pourtant de changements subtils dans les profils d'expression de gènes impliqués dans des processus de différenciation cellulaire. Le projet proposé visera à préciser le réseau génétique, conservé chez l'ensemble des vertébrés, qui détermine l'unité du prosencéphale dans ce groupe, mais également les variations qui provoquent les différences morphologiques manifestes entre les groupes de vertébrés. Cette analyse sera effectuée par l'étude systématique chez la roussette et la lamproie des profils d'expression de gènes codant pour des facteurs de transcription bien caractérisés chez les ostéichtyens, et impliqués dans la spécification précoce du neuroectoderme antérieur (gènes Hex, Hesx-1, Fox-a2, goosecoid), dans la régionalisation du tube neural (gènes Pax, Dlx, Emx, Nkx, Tb, Gsh, Lef, Ngn, TBr), dans les voies de signalisation qui jouent un rôle important dans cette régionalisation (Bmp, Fgf, Wnt, Shh), et dans des processus de différenciation neuronale (LIM-hd). Cette approche, par le choix des modèles roussette et lamproie, devrait permettre d'évaluer la conservation des profils d'expression embryonnaire des gènes étudiés, d'identifier des centres organisateurs potentiels du prosencéphale, et de comprendre comment se sont produites des innovations majeures à la base des vertébrés. Pour citer un exemple, la lamproie n'a pas de pallidum, composante majeure du sous-pallium des tétrapodes, impliquée dans la programmation du mouvement volontaire. L'analyse à travers nos familles de gènes de la spécification régionale et cellulaire dans le sous-pallium de la lamproie et la roussette permettra de proposer un scénario de l'émergence d'une structure cérébrale, et de la fonction qui lui est associée. Finalement, l'apport des banques génomiques sera un complément pour l'étude des séquences régulatrices et de leur évolution, permettant d'affiner avec l'apport de la transgenèse et des études de promoteurs les scénario évolutifs proposés (projet développé par S. Rétaux et S. Mazan, en collaboration avec I. Rodriguez-Moldes , M. C. Di Rodicio et M. Pombal).

Formation des structures nerveuses corticales chez les chondrichtyens. Les structures du cerveau des vertébrés sont organisées spatialement selon deux grands modes : nucléaire (les corps cellulaires sont disposés en amas) et cortical (disposition en couches). Les principales structures corticales sont essentiellement dorsales, à l'exception notable du bulbe olfactif : cervelet et toit du mésencéphale (toit optique/colliculus supérieur et torus semicirculaire/colliculus inférieur) chez tous les gnathostomes, et chez les mammifères seulement, pallium (télencéphale dorsal, qui donne le cortex cérébral dans ce groupe). En ce qui concerne le toit optique au moins, cette structure est anatomiquement (disposition en couches) et physiologiquement (fonctionnement en colonnes radiales) semblable chez les actinoptérygiens et les sarcoptérygiens ; en revanche les mécanismes de formation sont très différents dans les deux groupes (actinoptérygiens : zone mitotique marginale à croissance continue -Nguyen et al., 1999. J. Comp. Neurol. 413, 385-404- versus sarcoptérygiens : neuroépithélium ventriculaire sous-jacent à la structure, et à fonctionnement limité dans le temps). Rien n'est connu de la morphogenèse tectale chez les chondrichtyens. Nous avons isolé au cours d'un crible systématique par hybridation in situ (Nguyen et al., 2001. Mech. Dev. 107, 55-67) un grand nombre de gènes impliqués dans la morphogenèse tectale chez le médaka (poisson téléostéen). L'analyse de l'expression de certains de leurs orthologues chez la roussette serait d'un intérêt tout particulier : la compréhension des mécanismes de morphogenèse de structures corticales (toit optique donc, et éventuellement cervelet) chez ce chondrichtyen serait susceptible d'éclairer l'origine évolutive des mécanismes de corticalisation chez les vertébrés (projet développé par F. Bourrat, en collaboration avec S. Rétaux et I. Rodriguez-Moldes).

Organogenèse: origine et évolution des mécanismes moléculaires de l'organogenèse du squelette interne et des structures dentaires chez les vertébrés. Squelette interne et dents sont des caractères hautement informatifs pour qui veut étudier l'histoire évolutive des vertébrés. En effet, ces tissus durs sont des innovations évolutives exclusivement présentes dans ce taxon qui, de plus, montrent une extraordinaire diversité morphologique et constituent l'essentiel des données paléontologiques. La position phylogénétique de la roussette et son anatomie en font un sujet d'étude clé pour répondre à quelques questions qui sont depuis très longtemps et très régulièrement l'objet de controverses. Par exemple, l'hypothèse classique veut que les dents orales soient issues du recrutement, dans la mâchoire, des cascades génétiques à l'origine des denticules dermiques (présents à la surface de la peau de chondrichtyens actuels). Cependant, une hypothèse nouvellement proposée tend à préférer une " origine pharyngienne " des mécanismes moléculaires responsables des structures dentaires (Smith et al., 2003. Evol Dev. 5:394-413). La comparaison de la régulation de la mise en place des dents orales de la souris (très bien décrite), avec celle des dents pharyngiennes du poisson zèbre (très mal connue et sur laquelle nous travaillons avec d'autres équipes) et des denticules dermiques (aucune donnée actuellement) devrait apporter un nouvel éclairage très intéressant sur cette problématique. L'organisation ancestrale des nageoires, leur évolution (en particulier en membre chiridien chez les tétrapodes) et les problèmes d'homologie de structures associées sont aussi des questions très anciennes qui pourront énormément progresser grâce aux connaissances des mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des nageoires d'un chondrichtyen. La caractérisation du transcriptome à un moment pendant lequel se développe le squelette interne et les structures dentaires de la roussettes nous permettra d'identifier et d'étudier les patrons d'expression de gènes candidats pour un rôle dans leur mise en place (projet développé par D. Casane en collaboration avec M. Smith).

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