1. Ensemencer 5 ml de milieu 2xYT contenant l'antibiotique aproprié dans un tube en verre (18 cm de haut et 16 mm de diamètre) avec 5 µl de stock bactérien en glycérol.
2. Faire pousser 18 heures à 37 °C sous agitation linéaire (les tubes devant être pratiquelent à l'horizontale.
3. Transférer les bactéries dans des tubes à centrifuger de 10 ml.
4. Centrifuger les bactéries 10 minutes à 2000 g.
5. Eliminer le surnageant.
6. Ajouter 550 µl de solution P1 et resuspendre le culot.
7. Transférer en plaque 96 puits (Polyfiltronics, 2 ml/puit).
8. Ajouter 550 µl de solution P2. Sceller la plaque avec un couvercle adhésif et mélanger 10 fois par inversion. Incuber 10 minutes à température ambiante.
9. Ajouter 550 µl de solution P3. Sceller la plaque avec un couvercle adhésif et mélanger 10 fois par inversion. Incuber sur la glace pendant 30 minutes, avec agitation occasionelle.
10. Centrifuger 45 minutes à 6200 g.
11. Transférer 1,2 ml (ou plus) de surnageant de chaque puit vers une autre plaque 96 puits.
12. Fractionner l'ADN en passant 7 fois le surnageant à travers une aiguille (type 21G x 1").
13. Mettre en place le QIAwell 96 colonnes.
14. Déposer le surnageant fractionné sur les colonnes et appliquer le vide (-35 Kpa) jusqu'à ce que les colonnes soient sèches.
15. Laver les colennes 2 fois avec 1 ml de solution QW.
16. Eluer l'ADN avec 250 µl de solution QF préchauffée à 70 °C.
17. Ajouter 2 µl de glycogène 2 mg/ml (Appligene).
18. Ajouter 350 µl d'isopropanol et mélanger.
19. Centrifuger 1 heure à 6000 g et éliminer le surnageant.
20. Ajouter 500 µl d'éthanol 70 %.
21. Centrifuger 15 minutes à 6000 g et éliminer le surnageant.
22. Sécher le culot au Speed Vac.
23. Ajouter 30 µl de Tris:EDTA et laisser la nuit à température ambiante.
24. Transférer dans une plaque de microtitration 96 puits et stoquer à -20 °C.

Notes

Les tampons P1, P2, P3, QW et QF utilisés dans ce protocole sont ceux de QIAGEN.

Des équipements permettant l'automatisation des étapes 11 et 12 ont été fabriqués au Genoscope.

D'autres équipements, permettant l'automatisation des tâches 1 à 3 pour 96 échantillons sont en cours de réalisation au Genoscope.

Si vous utilisez ce protocole, merci de citer :
M. Salanoubat et F. Quetier
Genoscope - Centre National de Sequençage EVRY FRANCE.