Site du Genoscope

Une bactérie hautement compétente pour la transformation naturelle

2006-12-31T18:17:27Z

Caractéristiques du genre Acinetobacter

Le genre Acinetobacter est un groupe hétérogène qui réunit des bactéries ubiquitaires, trouvées dans l'eau, le sol, les organismes vivants, et même sur la peau humaine. Ces gamma-protéobactéries sont désormais classées dans l'ordre des Pseudomonadales et dans la famille des Moraxellacées. Au sein du genre, elles se répartissent actuellement en 32 espèces génomiques (définies par hybridation ADN-ADN), dont 17 ont été nommées (situation fin 2003). Leur situation taxonomique était autrefois beaucoup plus confuse, puisqu'elles étaient classées dans plus d'une dizaine de genres différents. Le genre Acinetobacter, quant à lui, est longtemps resté insuffisamment décrit, et a été redéfini à plusieurs reprises (lire une courte histoire du genre Acinetobacter).

Les bactéries gram négatives aujourd'hui classées dans le genre Acinetobacter se distinguent par les caractéristiques suivantes : elles sont oxydase-négatives, catalase-positives, aérobies strictes, à métabolisme respiratoire strict ; dépourvues de flagelle, elles sont immobiles, ne forment pas de spores, et apparaissent au microscope sous la forme de cocci (en phase stationnaire) ou de courts bacilles, souvent appariés, voire assemblés en chaînes plus longues.

Une autre caractéristique remarquable de nombreuses souches du genre Acinetobacter est qu'elles sont capables d'utiliser une gamme de composés très divers comme sources de carbone et d'énergie, et de croître sur des milieux relativement simples. Ce métabolisme robuste leur confère une capacité d'adaptation élevée qui explique que ces bactéries soient retrouvées dans des environnements variés, comme leurs cousines du genre Pseudomonas. Pour cette raison, elles suscitent un intérêt croissant en vue d'applications biotechnologiques et environnementales, telles que la bioremédiation (Abd El-Haleem, 2003). Certaines souches sont en effet capables de dégrader ou de séquestrer de nombreux composés polluants, notamment des composés aromatiques, des hydrocarbures et des métaux lourds, et de produire des bioémulsifiants. D'autres souches d'Acinetobacter au spectre nutritionnel plus étroit (attribuées majoritairement à l'espèce A. baumannii) ont quant à elles attiré l'attention par leur implication dans des infections nosocomiales.

Enfin, une souche particulière d'Acinetobacter a suscité un intérêt considérable, du fait de sa compétence remarquable pour la transformation naturelle : dans certaines conditions, plus d'une cellule sur cent peut être transformée par l'ADN présent dans le milieu, quelle qu'en soit la source, à condition qu'une région d'homologie demeure avec le génome receveur. Cette souche hautement transformable a été obtenue en 1969 par mutagenèse à partir d'une souche isolée du sol. D'abord décrite sous le nom de BD413, elle a été renommée ADP1 en 1995 (pour en savoir plus sur l'histoire de la souche Acinetobacter sp. ADP1).

Les raisons de l'intérêt pour la souche ADP1

Acinetobacter sp. ADP1 constitue un modèle intéressant pour l'étude de la compétence pour la transformation naturelle, qui est un état génétiquement programmé. Les bactéries naturellement compétentes peuvent trouver un avantage sélectif dans l'apport nutritif en nucléotides, la réparation des allèles mutés par conversion génique, ou encore l'acquisition de nouvelles fonctions par intégration d'ADN non homologue. Chez une bactérie gram- telle qu'Acinetobacter, le processus de transformation fait intervenir des structures homologues aux pili de type IV (impliqués par ailleurs dans la virulence, la formation de biofilms et la « twitching mobility ») et passe par l'importation de l'ADN exogène dans le périplasme. L'ADN double brin se lie à la cellule et est importé sous forme simple brin même lorsqu'il provient d'organismes non apparentés à Acinetobacter (Palmen et al., 1993). Dans le genre Acinetobacter, seules les souches dérivées, comme ADP1, de l'isolat du sol BD4 présentent cette compétence naturelle.

La compétence d'ADP1 a été exploitée dans de nombreux travaux. Par exemple, il est possible de transformer directement ADP1 par des produits de PCR. L'équipe de N. Ornston introduit ainsi des fragments d'ADN issus de mutagenèses par PCR, afin d'étudier l'expression de versions mutées de gènes hétérologues (Kok et al., 1999). Si l'on s'intéresse à présent à la diversité naturelle, on peut essayer de récupérer dans ADP1 des gènes nouveaux, aux fonctionnalités intéressantes, à partir d'ADN de souches isolées du sol ou d'autres environnements naturels. Par ailleurs, la transformation demeure efficace lorsqu'ADP1 est directement placé dans un échantillon de sol humide ou d'eau usée, (Lorenz et al., 1992), ce qui fait de cette souche un excellent modèle pour l'étude du transfert horizontal de gènes entre microorganismes de l'environnement. Acinetobacter sp. ADP1 peut même développer un état de compétence lorsqu'elle colonise une plante infectée par la bêta-protéobactérie Ralstonia solanacearum ; cela a permis d'étudier la possibilité d'un transfert horizontal d'ADN d'une plante transgénique vers une bactérie (Nielsen et al., 2000 ; (Kay et al., 2002). On envisage également d'exploiter la compétence de la souche ADP1 dans le sol pour récupérer des gènes nouveaux à partir de souches bactériennes non cultivables. De même, ADP1 reste transformable lorsqu'elle croît sous forme de biofilms. Ceux-ci pourraient donc être « augmentés » directement au sein de réacteurs et acquérir ainsi de nouvelles capacités de biocatalyse, par exemple dans le retraitement des eaux usées (Hendrickx et al., 2003).

La condition pour que la transformation naturelle ait lieu demeure bien sûr l'existence d'un degré d'homologie suffisant pour que l'ADN exogène s'intègre (Young et al., 2001). Cette exigence a été mise à profit pour valider les frontières du groupe Acinetobacter : Elliot Juni a testé en 1972 les ADN de 265 souches, aux phénotypes très divergents, pour leur capacité à restaurer la croissance sur milieu minimum d'un mutant ADP1 auxotrophe pour le tryptophane. Il a ainsi confirmé que toutes ces souches forment avec ADP1 un vaste genre, à l'exclusion des souches oxydase positives.

Enfin, la compétence élevée d'ADP1 constitue évidemment une aubaine pour l'étude génétique de cette souche non pathogène, dont la croissance rapide sur des milieux simples (temps de doublement inférieurs à une heure, à 30°C comme à 37°C) facilite la manipulation. Il est très facile de transformer ADP1 pour inactiver un gène, ou le placer sous le contrôle d'un nouveau promoteur. On dispose ainsi d'un moyen d'étude commode des voies métaboliques. Or celles-ci sont d'une grande richesse chez ADP1 : comme les autres souches d'Acinetobacter isolées de l'environnement, elle présente un large spectre nutritionnel (il s'agit même d'une des rares souches d'Acinetobacter à pousser sur glucose ; voir la liste des composés qu'ADP1 est capable d'utiliser comme unique source de carbone et d'énergie) et s'avère capable de dégrader de nombreux composés. Toutes ces raisons nous ont conduit à entreprendre le séquençage du génome d'ADP1 (voir Projet de séquençage). La séquence annotée a permis de mener des études de génomique comparatives avec les bactéries apparentées telles qu'Escherichia coli et les espèces du genre Pseudomonas ; elle permet aussi et surtout de mener un programme systématique d'inactivation des gènes d'ADP1, dans le but de faire de cette souche au riche répertoire génétique un organisme modèle pour l'étude des transformations métaboliques dans l'environnement.

Paysage génomique d'Acinetobacter baylyi ADP1

Le génome de la souche Acinetobacter baylyi ADP1 est composé d'un unique chromosome circulaire de 3 598 621 paires de bases (pb). Son contenu en G+C (GC%) est de 40,3% (les GC% des souches réunies dans le genre Acinetobacter sont compris entre 38% et 47%). Curieusement, cette valeur est assez éloignée de celles des trois espèces séquencées du genre Pseudomonas (GC% de 58,4% à 66,6%) alors que les comparaisons des séquences des ADNr 16S indiquent au contraire qu'Acinetobacter et Pseudomonas sont étroitement apparentées.

L'annotation de la séquence génomique d'ADP1 a été réalisée sur la plate-forme d'annotation de l'AGC (Atelier de Génomique Comparative) au Genoscope, et les données sont accessibles dans la base de données AcinetoScope. L'interface graphique d'annotation MaGe permet de visualiser les résultats de l'annotation automatique (courbes de probabilité de codage) avec les choix de l'annotateur et les données de synténie.

Le processus d'annotation, conduit en deux phases (linéaire le long du chromosome, puis par thématique biologique), a livré 3 325 séquences codantes (CDS). Leur longueur moyenne est de 930 pb ; la plus petite mesure 69 pb, la plus grande 11 133 pb. Nous avons aussi identifié 76 espèces d'ARNt et 7 opérons d'ARNr, ainsi que trois autres motifs ARN, dont les composantes ribonucléiques de la ribonucléase P et du complexe SRP (reconnaissance du peptide signal).

Les séquences répétées représentent 1,6% de la séquence génomique. Six copies d'une séquence d'insertion de la famille IS3 ont été identifiées, dont le GC% ne diffère pas sensiblement de la valeur globale du génome d'ADP1. Elles ne semblent donc pas avoir contribué de façon importante à des événements de transfert horizontal, tout au moins pour ce qui est des génomes donneurs au GC% très différent. L'analyse du génome a également révélé deux régions prophagiques principales. Dans la plus longue (54 kb) ont été identifiés 64 gènes, dont 45 sont uniques à Acinetobacter. Les autres ressemblent à des séquences phagiques trouvées chez Xyllela fastidiosa et Pseudomonas putida. Des études sont en cours pour déterminer si cette région correspond encore à un prophage fonctionnel. La séquence de la seconde région prophagique, qui mesure 9 kb, est quant à elle similaire à celle d'un phage filamenteux de Pseudomonas aeruginosa (Pf3).

Orthologues et synténie

Les comparaisons dans les bases de données ont permis d'assigner une fonction à plus de 62% des 3 325 gènes codant des protéines qui ont été identifiés dans la séquence génomique (35% de façon définitive, et 27% de façon putative). En outre, 20,3% des CDS ont été identifiées comme des protéines « hypothétiques conservées » (homologues à d'autres protéines sans fonction connue chez d'autres organismes). Enfin, 13,9% des protéines ont été désignées comme « hypothétiques », propres à Acinetobacter baylyi ADP1. Les 3,2% CDS restantes ont été annotées comme douteuses.

Comme l'étude phylogénétique basée sur l'ARN 16S l'avait déjà indiqué, les protéomes les plus proches de celui d'Acinetobacter baylyi ADP1 appartiennent aux trois espèces séquencées de Pseudomonas. Ce résultat apparaît lorsqu'on recherche les CDS d'Acinetobacter telles que le gène le plus homologue à la CDS considérée, au sein d'un autre génome, admet en retour cette CDS comme la plus homologue au sein du génome d'ADP1 (Bidirectionnal Best Hits, BBH). La souche ADP1 partage avec Pseudomonas aeruginosa plus de 63% de BBH. Viennent ensuite les deux autres espèces de Pseudomonas et deux autres gamma-protéobactéries séquencées, Ralstonia solanacearum et Escherichia coli. Si l'on considère à présent le pourcentage de CDS en synténie (définie comme la colocalisation chromosomique entre paires de gènes orthologues d'un génome à un autre), on trouve de nouveau P. aeruginosa comme la bactérie la plus proche d'ADP1, puis les espèces précitées, dans le même ordre. Enfin, si l'on considère les catégories fonctionnelles, on constate que les catégories les plus représentées, chez ADP1, sont les fonctions enzymatiques et les systèmes de transport. On retrouve une nette proximité d'ADP1 avec les autres bactéries de l'environnement, les Pseudomonas et la bactérie phytopathogène du sol Ralstonia solanacearum : ces génomes ont en commun une proportion élevée de gènes associés au transport des ions inorganiques, à la sécrétion et à la biosynthèse des métabolites secondaires, qui reflètent l'importance des interactions avec l'environnement. L'ensemble de ces résultats est accessible dans un tableau récapitulatif. Les résultats de BBH et de synténie sont visibles sous la forme d'un histogramme pour 37 génomes bactériens.

Nous avons identifié une région de 18 kb, délimitée par des groupes de synténie très bien conservés, qui semble l'indice d'événements de transfert horizontal. La conservation est très élévée avec les génomes du phytopathogène P. syringae, de deux Vibrio et avec le mégaplasmide de R. solanacearum. L'hypothèse de transferts horizontaux entre cette dernière bactérie et Acinetobacter n'est pas neuve : les souches du sol d'Acinetobacter, telles qu'ADP1, sont adaptées à la diversité biochimique créée par les plantes, et sont capables de coloniser les tissus végétaux de façon opportuniste lors d'une infection par R. solanacearum ; dans de telles niches, on a déjà observé entre les deux bactéries des événements de transfert conjugatif de plasmides et de transfert de gènes chromosomiques par transformation à des fréquences significatives (Kay et al., 2002).

Annotation fonctionnelle

Plus de 60% des gènes d'Acinetobacter baylyi ADP1 ont été trouvés dans des groupes de synténie avec les 145 génomes bactériens comparés. Cette conservation nous a permis de tenir compte de l'environnement en gènes lors de l'annotation fonctionnelle, ce qui s'est avéré particulièrement utile en cas de faible similarité avec des gènes de fonction connue. Certaines des caractéristiques les plus remarquables du répertoire de gènes d'ADP1 sont indiquées ci-dessous pour plusieurs grandes fonctions biologiques.

Réplication : La machinerie de réplication d'ADP1 est assez semblable à celle d'E. coli. Une particularité très intéressante est la fusion du gène dnaQ, dont le produit chez E. coli est responsable de l'activité exonucléase 3'->5' qui corrige les erreurs lors de la réplication, et du gène rnhA, dont le produit, la RNase HI, dégrade les amorces ARN à l'origine des fragments d'Okazaki lors de la synthèse du brin tardif. Chez les protéobactéries, ces deux gènes sont souvent colocalisés dans un groupe de synténie plus vaste, mais leur fusion n'avait jamais encore été observée. Elle pourrait permettre à la bactérie d'optimiser la synthèse du brin tardif.
Production d'énergie : La capacité d'ADP1 de croître sur glucose, malgré l'absence de plusieurs enzymes de la glycolyse (glucokinase, hexokinase et système phosphotransférase) a déjà été évoquée. Les détails du catabolisme du glucose chez ADP1 sont exposés sur une autre page.
Vie aérobie : Comme attendu, le génome d'Acinetobacter ADP1, une bactérie aérobie stricte, est dépourvu du gène fnr qui, chez E. coli, régule près de 70 gènes impliqués dans l'adaptation à un environnement anoxique. De même, on relève l'absence du gène oxyS, dont le produit est un petit ARN antisens impliqué chez E. coli dans la réponse au choc oxydatif.
Assimilation des nitrites et nitrates : Les gènes codant les protéines impliquées dans l'assimilation des nitrates forment un cluster. L'un de ces gènes, pour laquelle l'annotation automatique indique une similarité avec la FAD oxydoréductase de Ralstonia, semble en fait correspondre à un produit de fusion codant les petites sous-unités de la nitrite réductase et de la nitrate réductase. Les indices en ces sens sont les données de synténie et la nature des produits des gènes qui le flanquent (grandes sous-unités de la nitrite réductase et de la nitrate réductase).
Assimilation du sulfate : On retrouve bien dans le génome d'ADP1 les gènes codant les deux sous-unités de l'ATP sulfurylase. Cette enzyme estérifie le sulfate avec une molécule d'ATP pour donner l'adénosine 5' phosphosulfate (APS). En revanche, l'APS kinase, qui phosphoryle l'APS en phosphoadénosine 5' phosphosulfate (PAPS) chez les entérobactéries, est ici absente. L'ion sulfite, produit chez E. coli par réduction du PAPS, serait directement produit par réduction de l'APS chez Acinetobacter baylyi ADP1, au moyen d'une enzyme homologue à la PAPS réductase de E. coli, mais qui présente deux motifs caractéristiques d'APS réductases végétales et bactériennes.
Biosynthèse des polyamines : On avait déjà noté l'absence chez Acinetobacter des polyamines telles que la putrescine et ses dérivés, spermidine et spermine. Elles sont remplacées par le diaminopropane, que ces bactéries produisent en grande quantité. L'analyse du génome révèle comme attendu l'absence de la S-adénosylméthionine décarboxylase et de la spermidine synthétase, deux enzymes qui interviennent dans la production de spermidine à partir de la putrescine. On trouve toutefois chez ADP1 plusieurs décarboxylases qui devraient produire de la putrescine et de la cadavérine, alors que ces polyamines sont à peine détectables chez Acinetobacter baumannii.
Métabolisme des polysaccharides : (résultats discutés sur une autre page)
Ilots cataboliques : (résultats discutés sur une autre page)
Compétence pour la transformation : (résultats discutés sur une autre page)

Histoire du genre Acinetobacter

L'histoire des bactéries gram- aujourd'hui rassemblées dans le genre Acinetobacter est complexe. Ces bactéries ont été classées dans plus de 10 genres, dont « Achromobacter », Alcaligenes, « Bacterium », « Herellea », « Mima », Neisseria, ... Il s'agit en effet de bactéries ubiquistes, isolées indépendamment par différents auteurs à partir de sources variées, et pour lesquelles manquent des caractères d'identification spécifiques. Il en a résulté une grande confusion taxonomique.

Les premières souches d'Acinetobacter sont isolées en 1911, à partir du sol, par M.W. Beijerinck qui les nomme Micrococcus calcoaceticus. Ces bactéries sont par la suite redécouvertes et renommées à plusieurs reprises. En 1954, J. Brisou et A.R. Prévot créent le genre Acinetobacter pour rassembler, parmi les saprophytes gram- qui ne produisent pas de pigments (tribu des Achromobactereae), les bactéries immobiles. Le genre, sous-défini, inclut des bactéries manifestement non apparentées. En 1957, Brisou désigne A. anitratum comme l'espèce type. L'application du test à l'oxydase aux bactéries du genre Acinetobacter montre que ce genre rassemble des souches oxydase positives et oxydase négatives. En 1968, P. Baumann et ses collègues s'intéressent plus largement à une centaine de souches oxydase-négatives réunies dans le groupe Moraxella (bactéries gram- aérobies strictes et sans flagelle). Ils les soumettent à une étude de taxonomie numérique, où est testée la croissance à partir de 158 substrats carbonés différents. Baumann et al. montrent que ces souches se distinguent clairement des Moraxellas oxydase positives, en particulier par leur spectre nutritionnel beaucoup plus large, et proposent de les réunir au sein du genre Acinetobacter, redéfini comme indiqué dans l'introduction. En 1971, le "sous-comité pour la taxonomie des Moraxella et des bactéries apparentées" valide la décision de restreindre le genre Acinetobacter aux souches oxydase négatives.

Baumann et al. demeurent prudents quant à la subdivision du nouveau genre Acinetobacter. Ils proposent néanmoins l'existence de trois espèces, dont l'espèce type A. calcoaceticus. Les premiers travaux d'hybridation ADN-ADN par J. Johnson et al. confirment à la fois la nette séparation entre les souches du genre Acinetobacter et les souches oxydase-positives, mais aussi l'hétérogénéité des Acinetobacter. L'utilisation de la souche ADP1 dans des tests de transformation, en 1972, renforce encore ces conclusions. Il reste toutefois difficile de distinguer des espèces sur la base de leurs caractéristiques physiologiques, et, au début des années 1980, l'habitude est prise de considérer une unique espèce, A. calcoaceticus.

A partir de 1986 et des premiers travaux de P. Bouvet et P. Grimont, la taxonomie du genre Acinetobacter est réorganisée en combinant les résultats des hybridations ADN-ADN avec les caractères phénotypiques (pour des détails, voir la revue très complète de J.P. Euzéby). Ces études nombreuses aboutissent, fin 2003, à la définition de plus de 30 espèces génomiques, dont la moitié environ sont nommées. En 1997, l'analyse des séquences d'ADNr 16S de souches représentatives de l'ensemble des espèces génomiques alors décrites confirme la cohérence du genre et suggère l'existence en son sein de 5 grands groupes (Ibrahim et al., 1997), tandis que l'étude phylogénétique des gènes gyrB et rpoD, en 1999, conforte les relations de parentés des souches réunies au sein des différentes espèces génomiques (Yamamoto et al., 1999).

Le genre Acinetobacter a d'abord été classé dans la famille des Neisseriaceae, avec les genres Neisseria, Moraxella et Kingella. Durant la fin des années 1980, des études d'hybridation ADN-ARNr soulignent l'hétérogénéité de cette famille, dont J. De Ley propose d'exclure les genres Moraxella, Acinetobacter et Psychrobacter. En 1991, il réunit ces genres dans la nouvelle famille des Moraxellaceae (Rossau et al., 1991).

Histoire de la souche ADP1

Aspect des cellules d'Acinetobacter sp. BD4, l'isolat du sol d'où dérive ADP1.

La coloration à l'encre de chine révèle la capsule très épaisse qui entoure ces bactéries, ici sous forme de cocci isolés ou en chaine. La souche ADP1 (BD413) est un mutant minicapsulé de BD4. (photo tirée de Taylor et Juni, 1961)

L'origine de la souche ADP1 remonte aux travaux de W.H. Taylor et E. Juni en 1960. Ces deux auteurs étudiaient des bactéries gram- capables de synthétiser des polysaccharides capsulaires à partir de sources de carbone simples. Ils ont isolé à partir du sol une souche de cocci gram- capsulés capables d'utiliser le méso-2,3-butanediol comme seule source de carbone et d'énergie, et ont nommé cette souche BD4 (pour ButaneDiol). La capsule de BD4 est particulièrement épaisse (voir image encre de chine). Relâchés dans le milieu, les polysaccharides capsulaires, constitués de rhamnose, glucose, mannose et acide glucuronique (Kaplan et al., 1985), forment avec les protéines un complexe qui agit comme un émulsifiant efficace (Kaplan et al., 1987). Entreprise pour comprendre la biosynthèse de ces polysaccharides, l'étude du métabolisme des sucres chez BD4 montra que cette souche est capable de croître sur gluconate et sur glucose, en dépit de l'absence de la première enzyme de la glycolyse, la glucokinase. Le glucose 6-phosphate, au départ de la biosynthèse des polysaccharides, est en fait synthétisé par les voies d'Entner-Doudoroff et de la néoglucogenèse (voie d'Embden-Meyerhof), après que le glucose a été oxydé en gluconate (Taylor et Juni II et III, 1961). Lorsque la souche BD4, en 1968, fut classée dans le genre Acinetobacter et dans l'espèce A. calcoaceticus, il apparut qu'il s'agissait d'une des rares souches d'Acinetobacter capable d'utiliser un hexose comme seule source de carbone et d'énergie. Toutefois, de nombreuses autres souches sont capables d'oxyder le glucose ou d'autres sucres (Baumann et al.,1968).

En 1968, E. Juni et A. Janik voulurent étudier plus avant la biosynthèse de la capsule de BD4 en isolant les métabolites intermédiaires de cette biosynthèse : après mutagenèse au moyen de rayons ultraviolets ou d'acridine orange, ils sélectionnèrent plusieurs mutants non-capsulés, qu'ils cultivèrent par paires dans le but de mettre en évidence une complémentation par échange de métabolites. Plusieurs de ces cocultures donnèrent effectivement des cellules capsulées, mais ce phénotype ne pouvait être expliqué par la diffusion de métabolites d'un type de mutant à un autre : une fois isolées, ces cellules conservaient leur capsule. Juni et Janik exclurent également l'hypothèse d'une réversion vers le phénotype capsulé. Ils montrèrent que chaque mutant « néocapsulé » avait été transformé très efficacement par l'ADN du mutant cultivé avec lui, et que la souche sauvage BD4 était elle aussi compétente pour la transformation naturelle (la compétence n'est donc pas liée à l'absence de capsule). Cette découverte fortuite semble due au gonflement des cellules cultivées sur glucose ou gluconate, et à la libération d'ADN consécutive à leur éclatement. Une hypothèse pour expliquer le gonflement est l'augmentation de pression osmotique due à l'accumulation de phosphoénolpyruvate ; celui-ci est produit à partir du glycéraldéhyde 3-phosphate issu du catabolisme du glucose et qui, chez les mutants non capsulés, ne serait plus consommé dans la néoglucogenèse.

Juni et Janik remarquèrent que deux de leurs souches mutantes, BD413 et BD414, possèdaient en fait une minuscule capsule. La souche BD413 pouvait être cultivée en milieu liquide sans que les cellules s'agglutinent, comme le font les cellules des autres souches mutantes ou celles de la souche sauvage BD4 lorsqu'on les débarasse de leur capsule. Parce qu'elle était plus commode à manipuler, BD413 fut donc retenue pour des études ultérieures sur la compétence pour la transformation naturelle. En 1985, cette souche fut renommée ADP1 dans le laboratoire de Nicholas Ornston, à l'université Yale, et son appartenance à l'espèce Acinetobacter calcoaceticus a été remise en cause en 1996 sur la base d'une étude phylogénétique fondée sur la séquence de l'ADNr 16S (Strätz et al., 1996). Par conséquent, elle est désormais désignée sous le nom d'Acinetobacter sp. ADP1. (1) Liste des types de composés sur lesquels peuvent pousser certaines souches d'Acinetobacter : Hydrocarbures, alcools aliphatiques, glycol et polyols, hydrates de carbone, acides aliphatiques et composés aromatiques non azotés, acides aminés, amines et composés azotés divers.

(2) Les composés suivants peuvent être utilisés par ADP1 comme unique source de carbone et d'énergie (de nombreux autres composés, sur lesquels peuvent pousser certaines souches d'Acinetobacter, n'ont pas été testés) : Benzoate, p-hydroxybenzoate ; anthranilate ; salicylate ; férulate ; vanillate ; quinate ; shikimate ; cafféate ; coumarate ; chlorogénate ; acides dicarboxyliques à chaîne linéaire ; acétate ; acides gras à chaîne linéaire ; éthanol ; lactate ; pyruvate ; glucose.

Bibliographie

Abd El-Haleem, D. (2003) Acinetobacter : Environmental and Biotechnological Applications. African Journal of Biotechnology 2 : 71-74.

Baumann, P., Doudoroff, M., and Stanier, R.Y. (1968) A Study of the Moraxella Group II. Oxydative-negative Species (Genus Acinetobacter). J. Bacteriol. 95 : 1520-1541.

Beijerinck, M.W. (1911) Über Pigmentbildung bei Essigbakterien. Centr. Bakteriol. Parasitenk. Abt. II 29 : 169-176.

Bouvet, P.J.M., and Grimont, P.A.D. (1986) Taxonomy of the Genus Acinetobacter with the Recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov., Acinetobacter haemolyticus sp. nov., Acinetobacter johnsonii sp. nov., and Acinetobacter junii sp. nov. and Emended Descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter lwoffii. Int. J. Syst. Bacteriol. 36 : 228-240.

Brisou, J., and Prévot, A.R. (1954) Etudes de Systématique Bactérienne. X. Révision des espèces réunies dans le genre Achromobacter. Ann. Inst. Pasteur 86 : 722-728.

Hendrickx, L., Hausner, M. and Wuertz, S. (2003) Natural Genetic Transformation in Monoculture Acinetobacter sp. Strain BD413 Biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 69 : 1721-1727.

Ibrahim, A., Gerner-Smidt, P. and Liesack, W. (1997) Phylogenetic Relationship of the Twenty-one DNA Groups of the Genus Acinetobacter as Revealed by 16S Ribosomal DNA Sequence Analysis. Int. J. Syst. Bacteriol. 47 : 837-841.

Johnson, J.L., Anderson, R.S. and Ordal, E.J. (1970) Nucleic Acid Homologies Among Oxidase-negative Moraxella species. J. Bacteriol. 101 : 568-573.

Juni, E. (1972) Interspecies Transformation of Acinetobacter : Genetic Evidence for a Ubiquitous Genus. J. Bacteriol. 112 : 917-931.

Juni, E., and Janik, A. (1969) Transformation of Acinetobacter calco-aceticus (Bacterium anitratum). J. Bacteriol. 98 : 281-288.

Kaplan, N., Rosenberg, E., Jann, B., and Jann, K. (1985) Structural Studies of the Capsular Polysaccharide of Acinetobacter calcoaceticus BD4. Eur. J. Biochem. 152 : 453-458.

Kaplan, N., Zosim, Z., and Rosenberg, E. (1987) Reconstitution of emulsifying activity of Acinetobacter calcoaceticus BD4 emulsan by using pure polysaccharide and protein. Appl. Environ. Microbiol. 53 : 440-446.

Kay, E., Vogel, T.M., Bertolla, F., Nalin, R., and Simonet, P. (2002) In Situ Transfer of Antibiotic Resistance Genes from Transgenic (Transplastomic) Tobacco Plants to Bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 68 : 3345-3351.

Kok, R.G., Young, D.M., and Ornston, L.N. (1999) Phenotypic Expression of PCR-Generated Random Mutations in a Pseudomonas putida Gene After Its Introduction into an Acinetobacter Chromosome By Natural Transformation. Appl. Environ. Microbiol. 65 : 1675-1680.

Lorenz, M.G., Reipschlager, K., and Wackernagel, W. (1992) Plasmid transformation of naturally competent Acinetobacter calcoaceticus in non-sterile soil extract and groundwater. Arch. Microbiol. 157 : 355-360.

Nielsen, K.M., van Elsas, J.D., and Smalla, K. (2000) Transformation of Acinetobacter sp. strain BD413 (pFG4-nptII) with transgenic plant DNA in soil microcosms and effects of kanamycin on selection of transformants. Appl. Environ. Microbiol. 66 : 1237-1242.

Palmen, R., Vosman, B., Buijsman, P., Breek, C.K.D., and Hellingwerf, K.J. (1993) Physiological Characterization of Natural Transformation in Acinetobacter calcoaceticus. J. Gen. Microbiol. 139 : 295-305.

Porstendörfer, D., Gohl, O., Mayer, F., and Averhoff, B. (2000) ComP, a pilin-like protein essential for natural competence in Acinetobacter sp. BD413 : Regulation, modification, and cellular locaalization. J. Bacteriol. 182 : 3673-3580.

Rossau, R., Valandschoot, A., Gillis, M., and De Ley, J. (1991) Taxonomy of Moraxellaceae fam. nov., a new bacterial family to accomodate the genera Moraxella, Acinetobacter and Psychrobacter and related organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 41 : 310-319.

Strätz, M., Mau, M., and Timmis, K.N. (1996) System to Study Horizontal Gene Exchange Among Microorganisms Without Cultivation of Recipients. Mol. Microbiol. 22 : 207-215.

Taylor, W.H., and Juni, E. (1961) Pathways for Biosynthesis of a Bacterial Capsular Polysaccharide I. Characterization of the Organism and Polysaccharide. J. Bacteriol. 81 : 688-693.

Taylor, W.H., and Juni, E. (1961) Pathways for Biosynthesis of a Bacterial Capsular Polysaccharide II. Carbohydrate Metabolism and Terminal Oxydation Mechanisms of a Capsule-Producing Coccus. J. Bacteriol. 81 : 694-703.

Taylor, W.H., and Juni, E. (1961) Pathways for Biosynthesis of a Bacterial Capsular Polysaccharide III. Syntheses From Radioactive Substrates. J. Biol. Chem. 236 : 1231-1234.

Yamamoto, S., Bouvet, P.J., and Harayama, S. (1999) Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences : comparison with the grouping by DNA-DNA hybridization. Int. J. Syst. Bacteriol. 49 : 87-95.

Young, D.M., and Ornston, L.N. (2001) Functions of the mismatch repair gene mutS from Acinetobacter sp. strain ADP1. J. Bacteriol. 183 : 6822-6831.

Bactéries spécialisées dans la dégradation des polymères

2006-12-31T18:50:55Z

Le cluster des Cytophaga-Flavobacteria (nommé Cytophagales par la suite) représente un important sous-groupe des Bacteroidetes, une lignée de bactéries précédemment connue sous le nom de phylum des Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides (CFB). Les Cytophagales sont principalement des chimio-organo-hétérotrophes aérobies spécialisés dans la dégradation des polymères. Des études par FISH (Llobet-Brossa et al., 1998 ; Rossello-Mora et al., 1999 ; Glockner et al., 1999 ; Simon et al., 1999 ; Eilers et al., 2001) ont montré l'abondance des Cytophagales dans les systèmes marins. Des études sur l'écologie de ce groupe sont en cours (Jürgens et al., 1999 ; Rossello-Mora et al., 1999 ; Zubkov et al., 2001), plusieurs cultures pures ayant été isolées dans la mer du Nord (Eilers et al., 2001).

Alors que les Bacteroides et les bactéries apparentées sont principalement étudiés par des microbiologistes en milieu médical, l'intérêt des Cytophagales est beaucoup plus diversifié (pour de plus amples détails, voir Reichenbach, The Prokaryotes 1991) :

Pour les biotechnologistes, elles sont des producteurs d'exopolysaccharides (EPS) et de nombreuses enzymes particulières utilisées dans les applications techniques, comme les protéases, les glycosyl-hydrolases et les transférases. Plus de 20 % des 270 souches testées produisent des métabolites secondaires intéressants comme les beta-lactames.

Les microbiologistes reconnaissent de plus en plus le rôle central des Cytophagales, en tant que minéralisateurs du carbone organique, dans le cycle global du carbone. Elles sont, par exemple, un constituant important de la « neige marine » dans laquelle elles digèrent des particules de matière organique qui autrement sédimenteraient sur le plancher océanique et séquestrent le carbone atmosphérique. Comme susmentionné, elles représentent également une part importante des formes libres du plancton bactérien à la fois dans les océans et les lacs. De plus, elles représentent une fraction importante de la vie microbienne anaérobie benthique, catalysant probablement les processus fermentaires primaires dans la diagenèse des sédiments.

Du point de vue taxonomique, il doit être noté que le phylum des CFB est aussi divers que celui des Protéobactéries. Cela fut une grande surprise quand, dans le milieu des années 1980, l'analyse comparative des ARNr 16S a affilié les Cytophagales aérobies au genre anaérobie Bacteroides. Des études de génomique comparative entre les génomes de Bacteroides publiés et les bactéries proposées comme Cytophagales ont éclairé d'un jour nouveau cet aspect phylogénétique. De plus, Salinibacter spp. représente le premier membre halophile extrême du phylum. Les analyses phylogénétiques basées sur les ARNr 16S ont révélé que ces espèces s'enracinent en position basale dans le phylum et pourraient partager certaines caractéristiques avec le groupe frère des Chlorobi.

Enfin, bien qu'elles n'aient qu'une faible importance dans le cadre de la santé humaine, les Cytophagales ont aussi suscité des inquiétudes en matière de détérioration des aliments et de pathogénicité pour les poissons.

Des cultures pures, bien caractérisées et d'un maintien aisé sont disponibles. Ci-dessous, quelques détails sont donnés sur les souches proposées au séquençage :

Zobellia galactonivorans :

La souche DsijT de Zobellia galactonivorans a été isolée à partir de fragments de l'algue rouge Delesseria sanguinea. DsijT montre une croissance étalée sur agar, formant des colonies jaunes-oranges d'1 mm de diamètre en 3 jours à 20°C.
La souche DsijT est strictement aérobie, nécessite de l'eau de mer, est une bactérie chimio-organotrophe et hétérotrophe, avec un métabolisme oxydatif qui utilise l'oxygène en tant qu'accepteur d'électron. Le nitrate peut également être utilisé comme accepteur d'électron. La souche DsijT synthétise de la flexirubine et est capable de dégrader des substrats protéiques aussi bien que des polysaccharides comme l'agar, les carraghénanes kappa et iota, l'amidon et la gélatine. Elle ne présente pas d'activité de dégradation de la chitine ou de la cellulose, que ce soit sur substrat sur solide (papier) ou sur cellulose amorphe (CMC).
Par cytométrie de flux, la taille du génome a été estimée à environ 4,1 Mb. La séquence de l'ARNr 16S de la souche DsijT est proche de celle de Zobellia [Cytophaga] uliginosa, avec un pourcentage d'identité de 99,5 %, ces deux bactéries formant deux branches distinctes de la famille des Flavobacteriaceae.

Salinibacter ruber M8 :

Salinibacter ruber est une bactérie hyperhalophile Gram négative hétérotrophe qui partage son habitat avec les Archées halophile et leur ressemble par de nombreux traits comme la nécessité d'une concentration saline élevée, la pigmentation rouge, des concentrations intracellulaires en KCl très élevées et des enzymes fonctionnant à des concentrations salines élevées.
Par ailleurs, les protéines de Salinibacter présentent les traits caractéristiques des protéines halophiles comme un grand excès d'acides aminés acides, une faible proportion d'acides aminés hydrophobes et un contenu en sérine important.

Un annélide polychète thermotolérant

2007-01-09T21:53:44Z

Les Annélides sont caractérisés par l'apparition d'une cavité coelomique et de la segmentation. Ces particularités morphologiques n'ont pu être initiées que par la mise en place de programmes génétiques majeurs de différenciation et de développement des Métazoaieres au cours de l'évolution. A l'heure actuelle, ils sont largement sous-représentés dans les banques de séquences (moins de 1 000 séquences protéiques). La construction et le séquençage d'une banque d'ADNc complets chez Alvinella pompejana permettront ainsi de générer rapidement des informations moléculaires sur ce phylum. Ils apparaissent parfaitement complémentaires du projet français de séquençage du génome de l'Annélide Platynereis dumerilii. En effet, les séquences d'ADNc d'Alvinella constituteront un atout décisif dans l'annotation du génome de Platynereis et l'obtention des séquences de deux organismes ouvre la voie à de nombreuses comparaisons.

Outre cet intérêt évolutif, A. pompejana présente une thermotolérance exceptionnelle chez un eucaryote (de 20 à plus de 80 °C chez l'adulte) qui en fait l'organisme modèle parfait pour la production de protéines thermostables d'origine animale. La collection d'ADNc complets constituera ainsi une source unique de protéines thermostables :

Pour la détermination des structures de protéines eucaryotes, la reconstruction et cristallisation de complexes moléculaires et pour les études de protéomique au sens large,

Pour l'étude de systèmes biologiques complexes (adaptation moléculaire aux stress thermique, oxydatif, chimique,...),

Pour des applications médicales et biotechnologiques (études d'homologues de protéines responsables de maladies humaines, obtention de peptides antibactériens, d'enzymes à intérêt industriel thermostables, substitut sanguin,...).

Un champignon filamenteux modèle

2007-01-09T22:27:26Z

Abondance de modèles ne nuit pas

Fructifications de Podospora anserina. Après épuisement du milieu de culture, la reproduction sexuée a lieu : la fécondation est suivie de la formation de fructifications, les périthèces. Au sein de ces structures protectrices spécialisées se produisent la caryogamie (la fusion du noyau mâle et du noyau femelle) puis la méiose et enfin la formation des asques, qui contiennent chacun quatre ascospores binucléées. Quatre jours environ après la fécondation, les ascospores sont éjectées à l'extérieur du périthèce.

Le champignon filamenteux ascomycète Podospora anserina est un organisme modèle, utilisé pour l'étude génétique et moléculaire de plusieurs processus biologiques. Le vaste phylum des Ascomycètes comprend des espèces aux modes de vie très divers ; plusieurs sont cultivées en laboratoire et étudiées en tant que modèles par d'importantes communautés de chercheurs. Parmi les espèces modèles dont les génomes sont déjà séquencées, Neurospora crassa est la plus proche de Podospora anserina. Ces deux champignons appartiennent au même ordre, celui des Sordariales, au sein de la classe des Sordariomycètes. Les lignées de Neurospora et de Podospora auraient divergé depuis au moins 75 millions d'années.

En tant qu'espèce modèle, Neurospora crassa a été rendue célèbre par son rôle dans la naissance de la biologie moléculaire. C'est en effet grâce à la génétique de Neurospora que George W. Beadle et Edward Tatum ont pu établir la célèbre relation "un gène - une enzyme". Toutefois, le modèle Podospora anserina a été préféré de ce côté-ci de l'Atlantique, grâce aux travaux pionniers de Georges Rizet. Initiée par ces travaux, une riche tradition de génétique microbienne s'est constituée en France autour de Podospora et d'autres champignons filamenteux (Ascobolus immersus, Sordaria macrospora...), notamment à la faculté des sciences d'Orsay.

Podospora anserina est trouvé dans la nature sur les excréments d'herbivores. Cette espèce pratique la reproduction sexuée, avec un cycle haplobiontique (le noyau diplo&iauml;de issu de la caryogamie subit immédiatement la méiose) d'environ une semaine. Chez cet organisme haplo&iauml;de, les mutations sont donc mises en évidence facilement et rapidement. Les asques contiennent 4 spores, chacune contenant 2 noyaux haplo&iauml;des.

L'étude de Podospora anserina montre qu'on aurait tort de se limiter à un unique modèle tel que Neurospora crassa. Malgré leur relative proximité, les deux espèces présentent en effet des différences importantes. Podospora donne accès à d'autres phénomènes biologiques que Neurospora. En particulier, les hyphes de Podospora anserina subissent un phénomène de sénescence qui a établi ce champignon, depuis des décennies, comme un modèle d'étude des mécanismes du vieillissement. Chez Neurospora crassa, au contraire, la sénescence n'est pas observée de façon systématique. Par ailleurs, Podospora anserina ne présente pas
ou présente avec une efficacité moindre - les phénomènes d'extinctions géniques qui sont particulièrement efficaces chez Neurospora crassa, ce qui permet de développer chez le premier des technologies impossibles à mettre en oeuvre chez le second.

Processus biologiques étudiés chez Podospora anserina

Parmi les processus biologiques fondamentaux étudiés chez Podospora anserina, on peut citer :

Les dégénérescences cellulaires, et le rôle d'éléments infectieux non conventionnels dans ces syndromes et dans la sénescence.
Le contrôle de la fidélité de la traduction dans le cytosol, qui est impliqué dans la sénescence et qui jouerait notamment un rôle important dans la stabilité de ces éléments infectieux.
L'instabilité du génome mitochondrial, cause de dysfonctionnements des mitochondries que l'on trouve dans bon nombre de myopathies humaines, et son association avec le processus de sénescence, peut-être par l'intermédiaire de la fidélité de la traduction des protéines mitochondriales dans le cytosol.
La relation entre la sénescence et la fonction respiratoire dont la mitochondrie est le siège. Il s'agit là d'un thème que l'on retrouve dans l'étude du vieillissement chez d'autres espèces.
Un phénomène de mort cellulaire nommé incompatibilité végétative, qui suit la fusion de cellules somatiques d'individus génétiquement incompatibles.
La présence d'un prion, capable de s'agréger en fibres amylo&iauml;des tout comme dans les encéphalopathies spongiformes et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l'homme, et qui pourrait jouer un rôle dans l'incompatibilité végétative.
Le contrôle du développement au cours du cycle sexué et la différenciation cellulaire.
L'évolution des systèmes de reproduction sexuée et de la pluricellularité.

Les raisons du séquençage

Un nombre important de gènes impliqués dans ces différents processus ont été localisés, car Podospora anserina se prête bien à l'analyse génétique. Toutefois, peu de ces gènes ont été pour l'instant caractérisés au niveau moléculaire. Le séquençage du génome de Podospora anserina accélérera ces recherches en permettant :

De faciliter le clonage des gènes. Avec la disponibilité de la séquence complète, il sera déjà plus facile, dans les cas où l'on sait ce que l'on cherche, de cloner un morceau de séquence par PCR ou de le trouver dans les banques utilisées pour le séquençage et qui sont maintenant disponibles. Dans le cas contraire, la séquence génomique sera également utile : à l'heure actuelle, le clonage d'un gène de Podospora anserina par complémentation d'un mutant peut prendre jusqu'à un an ; or ce temps pourrait être réduit d'un facteur 10 par une procédure de clonage positionnel. On sait d'ores et déjà que Podospora anserina présente des micro et minisatellites polymorphes d'une population à une autre. Les gènes candidats repérés dans un intervalle entre certains de ces marqueurs pourraient alors être testés par complémentation fonctionnelle après transformation.
D'améliorer l'annotation de la séquence du génome de Neurospora crassa, et plus généralement celle des autres champignons filamenteux. En retour, la séquence génomique de Neurospora crassa facilitera bien sûr l'annotation de Podospora anserina.
D'engager des études comparatives sur le génome de ces champignons filamenteux, puis d'étendre les comparaisons aux génomes des levures, et, au delà, à ceux des métazoaires (les animaux constituent le groupe frère des champignons) et des plantes (dont les stratégies de vie sont similaires à celles des champignons). Il est à ce titre intéressant de souligner que les champignons filamenteux possèdent davantage de protéines homologues de protéines humaines que n'en possèdent les levures.
D'envisager la mise au point de puces à ADN échantillonnant l'ensemble des gènes de Podospora anserina en vue de l'étude des profils d'expression génique associés aux différents phénomènes cellulaires caractérisés chez ce champignon.

Le génome de Podospora anserina comprend 7 chromosomes. Sa taille, estimée par une analyse par électrophorèse en champ pulsé, est d'environ 34 Mb. Ce génome serait donc plus petit que celui de Neurospora crassa - 40 Mb environ -, qui a été séquencé en 2003 à une profondeur de plus de 10X. Parmi les autres champignons filamenteux séquencés à ce jour, citons Magnaporthe grisea - un autre sordariomycète - et, moins étroitement apparentés à Podospora, les espèces Fusarium graminearum, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Phanerochaete chrysosporium et Coprinus cinereus. Les génomes d'autres espèces encore, pour la plupart des pathogènes de l'homme ou de plantes, sont en voie d'être séquencés.

L'historique du projet

Dès septembre 2000, le Genoscope s'était engagé dans un projet pilote, portant sur la région centromérique du chromosome V de Podospora anserina. Ce projet avait été proposé fin 1999 par quatre laboratoires travaillant sur ce champignon. Leur but était d'étudier la faisabilité d'un projet de séquençage intégral. A la fin du projet pilote en janvier 2002 ont été obtenus deux contigs d'une taille cumulée de 480 kb, qui ont permis d'établir la valeur de 50% du pourcentage en GC de Podospora et la rareté des séquences répétées. Ces données sont favorables dans la perspective d'un séquençage aléatoire global (whole genome shotgun). Par ailleurs, ce projet pilote a aussi révélé la compacité du génome (gènes espacés de 1 kb en moyenne) et la petite taille moyenne des introns (60 pb), ce qui constituera un atout lors de l'annotation. Le gain immédiat du projet pilote a été l'identification de deux gènes impliqués dans des dégénérescences cellulaires, et de plus de 160 autres gènes à partir desquels ont été définis divers consensus pour l'identification des introns et des séquences codantes. Enfin, ces séquences devraient aider à l'identification d'un centromère de champignon filamenteux en vue de la construction d'un vecteur non intégratif pour ce type d'organisme.

Le projet de séquençage intégral a démarré en 2003 dans le cadre de l'appel à proposition « séquençage à grande échelle » du ministère de la recherche et des nouvelles technologies. Un financement a été alloué initialement pour la production au Genoscope d'un volume de séquence de 3X. Le projet est désormais étendu à un séquençage aléatoire global du génome de Podospora anserina à une profondeur de 10X. L'initiative en revient au conseil scientifique du Genoscope et à un consortium de 5 équipes françaises et d'une équipe néerlandaise (voir Collaboration), coordonné par l'équipe " Contrôle génétique de dégénérescences cellulaires " de l'Institut de Génétique et Microbiologie (UMR CNRS 8621) à l'université d'Orsay - Paris Sud. Le projet a en outre reçu l'appui de l'institut fédératif de recherche « Génome » du centre d'Orsay - Gif-sur-Yvette.

Outre la finition de la séquence génomique, le consortium « Podospora » se chargera de l'annotation. L'extrapolation à partir des séquences annotées dans le projet pilote indique la présence d'environ 11 000 gènes dans le génome de ce champignon. L'annotation profitera des séquences de clones d'ADNc de Podospora anserina également déterminées au Genoscope. Elle bénéficiera en outre de la comparaison avec le génome de Neurospora crassa, qui apparaît situé à la bonne distance évolutive pour que les deux génomes puissent être comparés par la procédure Exofish développée au Genoscope : plus de 95 % des gènes déjà repérés chez Podospora ont un homologue chez Neurospora, alors qu'introns et séquences intergéniques ne sont pas conservés. Les régions évolutivement conservées indiquées par Exofish correspondront donc à des exons avec une sensibilité et une spécificité élevée.

Philippe Silar et al. (2003) Characterization of the genomic organization of the region bordering the centromere of chromosome V of Podospora anserina by direct sequencing, Fungal Genetics and Biology 39 n�3, pages 250-263.

Les équipes associées au sein du consortium « Podospora » sont :

L'équipe « Contrôle génétique de dégénérescences cellulaires » de l'Institut de Génétique et Microbiologie (IGM, UMR CNRS 8621) à l'université d'Orsay.
L'équipe « Reproduction sexuée, traduction et différenciation » de l'IGM à l'université d'Orsay.
L'équipe « Sénescence et longévité chez P. anserina » au Centre de Génétique Moléculaire (CGM) du CNRS à Gif-sur-Yvette.
Le laboratoire de génétique moléculaire des champignons à l'Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires (IBGC, UMR CNRS 5095) de l'université Bordeaux II.
Le laboratoire "Réplication et expression des génomes eucaryotes et rétroviraux" (REGER) de l'université Bordeaux II.
Le Laboratoire de génétique de l'université de Wageningen.

Par ailleurs, les aspects informatiques du travail d'annotation seront pris en charge par l'équipe « Evolution moléculaire et génomique » de l'IGM à l'université d'Orsay.

La première espèce de reboisement industriel au monde

2007-01-09T22:31:05Z

photo JM Gion, CIRAD

La croissance rapide de l'eucalyptus ainsi que la qualité de son bois en font la première espèce ligneuse angiosperme de reboisement industriel dans le monde. Elle est également une espèce forestière modèle pour des approches de génomique fonctionnelle en relation avec la formation du bois et l'adaptation aux stress abiotiques de part la faible taille de son génome, la disponibilité de cartes génétiques et de QTLs.

Les travaux menés sur l'eucalyptus dans notre unité s'attachent à comprendre les mécanismes génétiques de la formation du bois et de l'adaptation au froid. Au-delà de ces aspects fondamentaux, les équipes impliquées ont pour objectif de valoriser leurs travaux en permettant l'amélioration de la qualité du bois d'eucalyptus et l'élargissement de l'aire géographique des plantations industrielles de cette espèce vers les zones tempérées, dont la France.

Gènes régulateurs de la formation du bois

La thématique est centrée sur un processus de différenciation unique chez les végétaux supérieurs qui conduit, à partir des cellules méristématiques cambiales, à la formation d'un tissu conducteur hautement spécialisé : le xylème secondaire, appelé bois chez les arbres. La xylogenèse met en jeu des centaines de gènes impliqués dans la division cellulaire, l'élongation, la mise en place d'une paroi secondaire lignifiée et la mort cellulaire. L'expression de ces gènes doit être strictement coordonnée et finement régulée à la fois dans le temps et dans l'espace pour aboutir à un tissu complexe constitué de plusieurs types cellulaires.

Notre objectif principal est d'étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la régulation de ce processus de différenciation. Dans ce but, nous nous attachons à identifier et à caractériser fonctionnellement des gènes régulateurs et, en particulier, des facteurs de transcription impliqués dans les différentes étapes de la xylogenèse. Nos travaux visent également à mieux comprendre le déterminisme génétique de la qualité du bois chez l'eucalyptus. Ce volet est réalisé en collaboration avec le CIRAD Forêt via la cartographie de gènes candidats et la recherche de localisation avec des QTLs liés à des composantes de la qualité du bois.

Afin d'identifier ces gènes candidats, 13 000 ESTs issues d'une banque d'ADNc de xylème d'eucalyptus ainsi que de banques soustractives enrichies en ADNc préférentiellement exprimés dans le xylème en formation seront séquencées dans le cadre de ce projet.

Réponses adaptatives au froid

Les travaux concernent l'étude de mécanismes adaptatifs aux conditions environnementales chez l'eucalyptus, caractère majeur pour la croissance, la productivité et la répartition géographique de cette espèce végétale, en particulier sur le territoire français. Basé sur une analyse du transcriptome, le programme vise à identifier et à étudier un pool de gènes impliqués dans la réponse au froid de l'eucalyptus avec un double objectif : l'étude fonctionnelle approfondie de certains de ces gènes afin de progresser dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de cette réponse adaptative et l'identification de gènes candidats pour la recherche de marqueurs fiables et précoces pour assister la sélection. Ceci nécessite d'isoler et de caractériser le maximum de gènes associés à la réponse au froid dans ses deux composantes : la tolérance intrinsèque et la capacité d'acclimatation (développement d'une tolérance supplémentaire après exposition à des conditions automnales : températures fraîches, luminosité et photopériode réduites...). Ainsi, l'isolement des gènes a consisté à construire deux banques. La première, basée sur la technique SSH, est enrichie en ESTs différentiellement exprimés (répression et induction) lors de l'acclimatation de suspensions cellulaires d'eucalyptus. La seconde banque d'ADNc construite à partir de feuilles d'un génotype d'eucalyptus très tolérant et acclimaté, contient en plus des gènes d'acclimatation, des gènes impliqués dans la tolérance de base. 13 000 clones issus de ces deux banques seront séquencés dans le cadre de ce projet.

Analyse d'une banque normalisée d'ADNc dans le cadre de l'étude de la dégénerescence rétinienne

2007-01-09T22:32:17Z

Les rétinopathies pigmentaires (RP ; 268 000), qui affectent 30 000 à 40 000 personnes en France, font partie d'une large liste d'affections orphelines jusqu'ici incurables.

Il s'agit d'un groupe hétérogène de maladies ayant des caractéristiques communes et qui consistent en un affaiblissement irréversible de la vision périphérique. Chez les personnes atteintes, les photorécepteurs à bâtonnets, qui permettent de voir la nuit et en périphérie, sont détruits. En conséquence, les premiers signes cliniques sont une cécité nocturne (une sorte de flou total au passage du jour et de la nuit) et un champ visuel qui se rétrécit en périphérie. Ce champ diminue progressivement jusqu'à rendre la vision « tubulaire », comme au travers d'un tuyau étroit.

Cultures enrichies en cônes

Puis fréquemment, les cônes sont à leur tour atteints. Le système des photorécepteurs à cônes assure non seulement la vision colorée mais aussi la vision à haut contraste, l'acuité visuelle et toutes les fonctions visuelles en atmosphère lumineuse normale. A mesure que la maladie progresse, la vision centrale se réduit, jusqu'à ce que le sujet devienne aveugle. Les premiers symptômes débutent habituellement à l'adolescence (entre 10 et 20 ans). L'évolution de la maladie se produit généralement sur 20 à 30 ans. Et vers 60 ans, la vision est inférieure à 1/10 (cécité). Les cônes sont aussi touchés dans une affection polygéniques du vieillissement, la dégénérescence maculaire liées à l'âge (DMLA).

Parmi les approches correctives proposées actuellement, la thérapie génique a un champ d'application restreint puisqu'elle est sélective, et les approches neuroprotectrices ont des applications potentielles larges mais sont peu spécifiques. En effet, plus de 100 gènes différents ont été identifiés pour les RP, ce qui pose un problème pour le développement d'approches de thérapie génique corrective.
Les orientations prises par l'Unité Inserm-Paris VI partent de l'analyse des évènements conduisant à la dégénérescence secondaire des cônes, afin de développer des stratégies de limitation de leur disparition. Le fait que cette dégénérescence survienne après celle des bâtonnets, a conduit à envisager l'hypothèse d'une dépendance trophique des cônes sur les bâtonnets. La transplantation de bâtonnets chez un modèle animal porteur d'une rétinopathie pigmentaire a été réalisée à un stade où l'ensemble des bâtonnets a dégénéré et où les cônes ont seulement entrepris leur processus de dégénérescence. Cette intervention ralentit de moitié la dégénérescence des cônes.

L'Unité Inserm-Paris VI a entrepris de caractériser les facteurs de survie des cônes en revue systématiquement l'ensemble des gènes exprimés par la rétine normale afin de trouver ceux qui pouvaient bloquer la mort des cônes. Ces travaux ont conduit à l'identification d'une première protéine, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) sécrétée et exprimée spécifiquement par les bâtonnets (608791).

Comptage des cellules

Le séquençage d'une banque normalisée de rétine de souris au Genoscope permettra d'optimiser ces recherches de facteurs de viabilité des cônes par clonage par expression assortie à une analyse bioinformatique.

Cette découverte marque donc une étape essentielle vers l'objectif thérapeutique et ouvre de nombreuses perspectives. En effet, les applications, basées sur l'administration de RdCVF, sont potentiellement larges puisque l'expression de la protéine est indépendante de l'anomalie génétique de la maladie. Elles sont mêmes envisageables à des stades avancés (5% de cônes résiduels sont suffisants pour conserver une vision ambulatoire alors que la fonction de 50% des cônes assure une acuité visuelle normale).
La valorisation de cette recherche par d'éventuels prolongements cliniques seront réalisées dans le futur Institut de la Vision.

Genoscope entreprend le séquençage d'une banque normalisée de cDNA de rétine de souris constituée de 8 000 cDNA (1,8 kb) contenant une phase ouverte de lecture entière. A l'issue du séquençage en 5', une sélection sera réalisée afin d'isoler les clones les plus intéressants, qui seront alors séquencés en 3' puis finis entièrement. Ce projet devrait conduire à un volume d'environ 50 000 lectures.

Contacts :
Patrick Wincker (Genoscope) - Thierry LEVEILLARD (INSERM) - José SAHEL

Le locus PIS : un exemple d'inversion sexuelle chez les chèvres

2007-01-09T22:33:44Z

Chèvre de race chamoisé, hétérozygote pour la mutation PIS (Photo INRA)

Les gènes du locus PIS sont les premiers gènes identifiés dans l'apparition du phénotype d'inversion sexuelle de type male XX et ils s'avèrent primordiaux dans la différenciation ovarienne précoce, pour laquelle très peu d'acteurs sont connus.

La compréhension du mécanisme d'action des 3 gènes du locus ainsi que de la région régulatrice commune (région PIS, délétée chez les animaux mutants) apparaît fondamentale afin de progresser dans la dissection moléculaire de la différenciation sexuelle chez les mammifères. Par ailleurs, ce locus, chez les individus XY, doit représenter une cible du acteur déterminant des testicules, le gène SRY (Sex-determining Region of Y chromosome). Or, bien que SRY ait été découvert en 1989, aucune cible moléculaire de ce facteur de transcription n'a pu être mise en évidence jusqu'alors.

Ce projet de clonage positionnel chez un animal domestique a été initié par le Pr Marc Fellous qui étudie ce type de pathologie dans l'espèce humaine.
Certains patients ont des phénotypes très masculinisés en absence du gène SRY. Ces phénotypes sont très similaires à ceux observés chez la chèvre et pourraient résulter d'un dysfonctionnement de la région PIS. Afin de tester cette hypothèse, il faut au préalable déterminer chez la chèvre quels sont les éléments importants dans la région PIS, afin de savoir où chercher des mutations chez l'homme.
Par ailleurs, le gène FOXL2 est responsable du syndrome BPES, qui associe, à l'état hétérozygote, une malformation des paupières à une insuffisance ovarienne chez les individus XX. Bien que la plupart des patients BPES présentent des mutations dans l'ORF de FOXL2, certains ont des translocations localisées entre FOXL2 et la région PIS. Ceci supporte l'hypothèse qu'il existe des régions régulatrices éloignées de FOXL2, et autres que la région PIS qui n'a pas d'influence sur l'expression de FOXL2 dans les paupières.

Les pertes estimées pour la vigne en France correspondent à 15-40% des récoltes selon les conditions climatiques

2007-02-12T13:47:46Z

Introduction

Botrytis cinerea (forme imparfaite du téléomorphe Botryotinia fuckeliana) est un des principaux champignons pathogènes de la vigne, responsable de pertes importantes pour la viticulture française et européenne.
B. cinerea est un champignon haploïde Euascomycète, de la classe des Leotiomycètes, dont le génome a une taille de 30 Mb. C'est une espèce modèle pour l'étude du processus infectieux des champignons phytopathogènes. En effet, ce champignon provoque des infections caractérisées par la destruction rapide des tissus de sa plante hôte au fur et à mesure de sa colonisation (nécrotrophie).

Interêt du séquençage du génome de Botrytis cinerea

Le projet de séquençage du génome du champignon B. cinerea s'inscrit dans le cadre d'une analyse moléculaire de l'écosystème « vigne et ses pathogènes » incluant le phytoplasme Stolbur. La caractérisation des génomes de la vigne et ses principaux agents pathogènes (B. cinerea, Stolbur) offre l'opportunité d'étudier les mécanismes impliqués dans les interactions entre la vigne et ses pathogènes ainsi que dans la dynamique de ces pathogènes dans l'écosystème « vigne ».

Les séquences génomiques permettront de réaliser des puces à ADN de la plante hôte et de ses pathogènes qui seront utilisées pour identifier les gènes induits ou réprimés lors d'une infection. La validation de ces analyses transcriptionnelles sera facilitée par le développement d'outils de génomique fonctionnelle chez chaque organisme. L'analyse moléculaire des deux partenaires d'une interaction plante pathogène est nécessaire pour mieux comprendre ces maladies et proposer de nouvelles méthodes de lutte.

Importance économique de Botrytis cinerea

Les champignons filamenteux sont les principaux agents pathogènes des plantes et les dommages provoqués par ces microbes sont responsables d'environ 20% des pertes des récoltes mondiales. B. cinerea est l'agent responsable de la pourriture grise de la vigne et de maladies de plusieurs centaines de plantes hôtes. Les pertes provoquées par ce champignon correspondent à 20% des récoltes mondiales des cultures concernées et leur coût est estimé à 10-100 milliards d'euros par an.

Les pertes estimées pour la vigne en France correspondent à 15-40% des récoltes selon les conditions climatiques. Ces pertes sont estimées à 20-25% des récoltes de fraises en Espagne et à 20% des fleurs coupées aux Pays-Bas.
La lutte contre les maladies fongiques provoquées par B. cinerea nécessite l'emploi de fongicides, la modification des pratiques culturales et le développement de cultivars résistants ou tolérants. Ainsi, les traitements fongicides contre B. cinerea ont coûté environ 540 millions d'euros pour l'année 2001, ce qui représente 10% du marché mondial des fongicides (rapport annuel UIPP, 2002). Par ailleurs, l'importance des traitements fongicides contre ce champignon provoque l'apparition de souches résistantes, nécessitant le développement de nouvelles molécules (Leroux et al., 2002 Pest Manag. Sci. 58 : 876).

Les dégâts provoqués par la pourriture grise ont un impact économique désastreux sur de nombreuses cultures, notamment le vignoble français. Il existe cependant des conditions climatiques particulières dans lesquelles B. cinerea provoque des symptômes de pourriture noble qui permettent l'élaboration de vins liquoreux à haute valeur ajoutée tel que le Sauternes.

Intérêt phylogénétique de Botrytis cinerea

De par son caractère polyphage et nécrotrophe, B. cinerea est un bon modèle d'étude des processus infectieux fongiques. Ce champignon s'attaque préférentiellement aux fruits (raisin, fraise, tomate) et aux fleurs sur lesquels il provoque une pourriture grise. Il est aussi capable d'attaquer les tiges, les feuilles et les semences. Ainsi, il a été montré au laboratoire qu'un même isolat est capable d'attaquer des plantes hôtes très différentes (haricot, vigne, tomate, arabette, rose) et des organes très variés de la même plante (fruits, feuilles, pétales).
B. cinerea provoque des infections caractérisées par la destruction rapide (macération, nécrose) des tissus de sa plante hôte au fur et à mesure de sa colonisation (nécrotrophie). B. cinerea est donc un excellent modèle pour étudier ce type de processus infectieux caractéristique de nombreuses maladies fongiques des plantes. Ce champignon met en oeuvre une panoplie importante de facteurs de pathogénie (enzymes lytiques, formes activées de l'oxygène, toxines, hormones végétales) pour attaquer ses plantes hôtes, dont la vigne. L'accès à son génome devrait permettre l'identification des gènes et des fonctions impliquées dans ce type de processus infectieux.

Intérêt de Botrytis cinerea comme modèle génétique et moléculaire

La majorité des espèces fongiques pathogènes des plantes sont des Ascomycètes appartenant à trois classes, les Sordariomycètes, les Loculoascomycètes et les Leotiomycètes.
Le groupe des Sordariomycètes comporte des espèces modèles non pathogènes comme Neurospora crassa et Posdospora anserina pour lesquels des recherches fondamentales sont menées sur des processus biologiques essentiels, et des espèces pathogènes des plantes comme Magnaporthe grisea et Fusarium graminearum.
Les génomes de N. crassa, M. grisea et F. graminearum ont été séquencés (NSF-Broad Institute, USA), ainsi que celui de P. anserina (Genoscope). Pour les Leotiomycètes et les Loculoascomycètes, il n'existe pas de séquences accessibles à la communauté scientifique. Un projet de séquençage du champignon phytopathogène Sclerotinia sclerotiorum appartenant à la classe des Leotiomycètes a été initié dans le cadre d'un appel d'offre NSF-Broad Institute en 2004. Ce champignon, bien que proche taxonomiquement de B. cinerea, en diffère par de nombreux caractères biologiques et moléculaires (voir paragraphe ci-dessous). Le séquençage du génome de B. cinerea devrait donc permettre d'obtenir une nouvelle ressource génomique d'un champignon phytopathogène représentant des Leotiomycètes.

B. cinerea est un Eucaryote qui se prête à un séquençage complet de par la nature haplo&iauml;de de son génome et de par sa relative petite taille (30 Mb). Par comparaison avec les génomes des Ascomycètes séquencés, on peut estimer que ce champignon possède environ 10 000 à 12 000 gènes. Ils sont répartis sur une dizaine de chromosomes. Par ailleurs, bien que la biologie moléculaire sur B. cinerea ne se soit développée que depuis une dizaine d'années, tous les outils de génétique classique et moléculaire (croisements, transformation, recombinaison homologue et remplacement de gènes, mutagenèse insertionnelle et collections de mutants, EST, macroarrays, banques génomique et d'expression) sont déjà à notre disposition pour mener des études de génomique fonctionnelle.

Un tunicier modèle pour l'étude des chordés

2007-02-13T10:07:01Z

Les tuniciers, chordés invertébrés

L'organisme marin Oikopleura dioica est intéressant à plus d'un titre. Tout d'abord, la famille des Oikopleuridés, à laquelle appartient ce minuscule animal, arrive en deuxième position parmi les groupes d'animaux les plus abondants du plancton de l'ensemble des mers. Ensuite, Oikopleura dioica possède le plus petit génome connu à ce jour parmi les animaux - 72 Mb seulement. Cela en fait un organisme de choix pour un projet de séquençage, d'autant qu'il peut être facilement et rapidement multiplié en captivité. Enfin et surtout, Oikopleura dioica appartient au phylum des Chordés, dont font également partie les Vertébrés. Sa position phylogénétique le rend particulièrement intéressant pour l'étude génomique de l'émergence des Vertébrés et de leurs caractéristiques fondamentales.

Larve d'Oikopleura en cours d'organogenèse

Simplicité anatomique d'une larve d'Oikopleura dioica en cours d'organogenèse après quatre heures de développement : les cellules du muscle (en haut) et du système nerveux central (en bas) sont révélées par hybridation in situ avec deux sondes ARN.

Apparus il y a au moins 600 millions d'années, les Chordés sont des animaux munis d'une chorde (ou corde, ou notocorde), une tige dorsale de cellules turgescentes dont la rigidité assure une fonction de soutien dans l'axe de l'animal. Ils se distinguent également par la possession d'un tube neural dorsal. Le phylum des Chordés comprend trois sous-phylums : les Urochordés, ou Tuniciers, auxquels appartient Oikopleura dioica ;les Céphalochordés, représentés par le célèbre amphioxus, petit animal marin en forme de poisson ; et les Vertébrés, groupe frère des Céphalochordés, chez qui la corde disparaît au cours du développement et est remplacée par la colonne vertébrale. Au sein des Tuniciers, Oikopleura appartient à la classe des Appendiculaires. Ces animaux conservent leur corde tout au long de leur vie. Ils se distinguent en cela d'autres tuniciers, les ascidies, dont les larves nageuses à l'allure de têtard présentent une corde, mais subissent une métamorphose au terme de laquelle cette structure est perdue : les ascidies adultes sont des animaux fixés à l'allure de sac en lesquels il est difficile de reconnaître des cousins des vertébrés.

L'intérêt pour les chordés invertébrés a redoublé lorsqu'on a confirmé que les bases moléculaires de nombreux aspects du développement des vertébrés sont conservées chez ces animaux. Par exemple, le gène Brachyury joue un rôle similaire dans le développement de la queue chez les vertébrés et chez les tuniciers, tandis que l'homologue du gène Pax-2 chez les tuniciers intervient, comme chez les vertébrés, dans l'établissement de la frontière entre mésencéphale et rhombencéphale. Des aspects complexes du développement des vertébrés, comme la mise en place du système nerveux central, pourraient donc être étudiés avec profit chez ces animaux plus simples que sont les chordés invertébrés.

Oikopleura dioica, tunicier modèle

La « maison » à laquelle le genre Oikopleura doit son nom (grec Oikos : maison, foyer) est une logette gélatineuse qui abrite l'animal tout en lui permettant de filtrer l'eau de mer. Les protéines constitutives de la maison, les oikosines, sont sécrétées par un épithélium spécialisé, dit oikoplastique. Chez Oikopleura dioica, la maison est entièrement renouvelée toutes les 3 ou 4 heures.

Les organismes les plus étudiés parmi les Céphalochordés et les Urochordés sont respectivement les amphioxus Branchiostoma floridae et belcheri et plusieurs espèces d'ascidies, parmi lesquelles Ciona intestinalis, dont le génome de 160 Mb a fait l'objet d'un projet de séquençage en 2001 et 2002. L'amphioxus ne peut être reproduit en captivité, ce qui limite son intérêt comme modèle. Ciona intestinalis, en revanche, a déjà fait l'objet de nombreux travaux, du fait de son maintien plus aisé en aquarium, de son embryogenèse rapide et de la facilité à suivre la différenciation cellulaire chez la larve. Toutefois, l'adulte est un animal relativement gros, fixé, très différent de la larve, comme on l'a déjà indiqué, puisqu'il a perdu le plan d'organisation typique des chordés. En outre, la génétique chez Ciona est encore très peu développée.

Le choix d'Oikopleura dioica comme tunicier modèle est motivé par plusieurs caractéristiques qui rendent l'étude de ce tunicier très complémentaire de celle de Ciona. Tout d'abord, comme chez tous les appendiculaires, l'adulte, issu d'une métamorphose moins sévère que chez Ciona, conserve un plan d'organisation de chordé, en particulier une queue mobile (bien qu'il vive dans une logette gélatineuse sécrétée par l'épiderme), ce qui le rapproche des vertébrés. L'adulte est très petit (cinq millimètres au total, avec un tronc d'un millimètre), et des centaines d'individus peuvent être aisément produits dans de simples béchers d'eau de mer pourvus en microalgues. A cela s'ajoute un temps de génération extrêmement court (quatre jours à 20 �C, contre trois mois pour Ciona intestinalis).

Oikopleura dioica possède une remarquable fécondité, comme l'illustre l'image de cette femelle en train de pondre.

Des méthodes pour maintenir et croiser ces animaux ont été développées au centre Sars à Bergen en Norvège et une lignée pure a d'ores et déjà été obtenue par des croisements répétés entre individus apparentés. L'ensemble de ces caractéristiques confère à Oikopleura dioica (objet central ou annexe des recherches d'au moins huit groupes dans le monde) un potentiel important pour des études génétiques d'une grande ampleur, rapprochant de la puissance des modèles invertébrés que sont la drosophile et le ver Caenorhabditis elegans. En outre, des méthodes de transgénèse utilisant des vecteurs rétroviraux sont en cours de mise au point au centre Sars. Enfin, un atout majeur d'Oikopleura dioica est son génome de 72 Mb seulement, le plus petit connu dans le monde animal. Cette valeur correspond à une estimation par cytométrie de flux et a été confirmée par la suite par diverses statistiques sur les séquences génomiques (voir ci-dessous) ; elle traduit la compacité importante du génome (très faible taille des séquences intergéniques et des introns), qui est un avantage pour un projet de séquençage, tant au niveau de l'assemblage (par la réduction de la difficulté causée par les séquences répétées) qu'au niveau de l'annotation.

Historique du projet de séquençage

L'image de ce mâle adulte illustre l'un des avantages du modèle Oikopleura dioica : cet animal demeure transparent tout au long de son cycle de vie.

La découverte de la petite taille du génome d'Oikopleura dioica a conduit dès 1999 le centre international de biologie marine Sars (Bergen, Norvège) à fonder ses travaux sur des données de séquençage à grande échelle. Deux groupes, celui de Daniel Chourrout et celui d'Eric Thompson, travaillent au Sars sur Oikopleura dioica et ont déjà obtenu des résultats importants sur l'organisation du génome et de la chromatine, le développement, le cycle cellulaire et l'expression des gènes. Les chercheurs du Sars ont obtenu le soutien du Max Planck Institute for Molecular Genetics (MPIMG) à Berlin (département de Hans Lehrach) pour un premier effort de séquençage aléatoire. L'assemblage de ces premières lectures shotgun début 2002 a donné 44 000 contigs couvrant 41 Mb du génome d'Oikopleura. Ces lectures aléatoires ont permis en outre de confirmer, via leur degré d'assemblage et leur alignement sur des collections d'EST et de BAC, la petite taille du génome, avec des estimations qui sont même inférieures à 70 Mb. Le MPIMG a également séquencé 25 clones BAC contenant des gènes intéressants, tels que les gènes Hox.

En 2003, le Sars a décidé de prolonger cet effort initial de séquençage en proposant au Genoscope un projet de séquençage aléatoire global d'une profondeur de 10 X : le but est cette fois d'obtenir un assemblage couvrant l'ensemble de la partie euchromatique du génome. L'assemblage devrait tirer un grand bénéfice de l'utilisation d'une lignée pure, une opportunité pour le moment unique chez les invertébrés deutérostomes (ce n'est en effet le cas ni de Ciona, ni des amphioxus, ni des deux oursins en cours de séquençage).

Intérêts du génome d'Oikopleura dioica en génomique comparative

Quels enseignements sur les innovations des chordés pourront-ils être tirés de l'analyse du génome d'Oikopleura dioica ? Les résultats obtenus sur l'ébauche génomique de Ciona intestinalis en donnent un aperçu. L'annotation de Ciona, ainsi que l'analyse préliminaire des données de séquence d'Oikopleura, indiquent que les deux tuniciers possèdent aux alentours de 15 000 gènes, soit environ la moitié du nombre de gènes des vertébrés. Cela refléterait l'importance des événements de duplication génique survenus dans la lignée des vertébrés, après leur séparation du reste des chordés. Les gènes de Ciona et d'Oikopleura possèdent donc un degré de redondance moindre que ceux des vertébrés, ce qui est un atout pour des expériences de génomique fonctionnelle.

Le séquençage et l'annotation d'une région génomique de 140 kb clonée dans un BAC ont permis d'illustrer la très forte compacité du génome d'Oikopleura dioica. Au total, pas moins de 33 gènes sont prédits, dont 29 sont confirmés par étude d'expression. Les rectangles rouges représentent les exons et les rectangles verts représentent les sequences répétées.

Peut-on pour autant considérer que les génomes des deux tuniciers correspondent au génome du chordé ancestral, dernier ancêtre commun à l'ensemble des chordés ? Une ascidie comme Ciona intestinalis est un organisme hautement spécialisé, qui a sans doute perdu de nombreux gènes de ce cordé ancestral et en a acquis d'autres depuis la divergence de sa lignée. La distance importante entre Ciona et Oikopleura, ainsi que leurs différences notables d'organisation, permettront d'obtenir une bien meilleure représentation de l'identité génétique des urochordés et du résultat de leur adaptation diversifiée, mais aussi de leurs différences avec les vertébrés et les invertébrés non chordés. Grâce à ces informations, on pourra imaginer avec plus de précision ce qu'était le génome de l'ancêtre commun de tous les chordés. La comparaison avec les génomes d'autres invertébrés révélera les gènes apparus spécifiquement dans la lignée des chordés, tandis que la comparaison avec les génomes des deux poissons et des deux mammifères séquencés à ce jour révélera les gènes apparus tôt dans la lignée des vertébrés (en premier lieu, gènes neuraux et gènes primordiaux du système immunitaire adaptatif).

Les chaetognathes : une position clé dans l'arbre phylogénétique des bilatériens

2007-02-13T10:07:52Z

Les chaetognathes sont de petits invertébrés marins (longueur de 2 à 120 millimètres), pour la plupart planctoniques. Leur corps transparent, longiligne et fuselé, doté d'ailerons latéraux et caudal, leur a valu le nom d'« arrow worms » (vers flèches). Ces animaux nageurs sont des prédateurs : ils possèdent autour de la bouche des crochets chitineux, rétractables au sein d'un capuchon, d'où leur nom grec (chaetognathe, poil-mâchoire). Ils se nourrissent de petits invertébrés tels que les copépodes, voire d'alevins. Le plan d'organisation des chaetognathes est très simple : deux septa transverses cloisonnent la cavité générale et délimitent une tête, un tronc (avec le coelome génital femelle) et une queue (avec le coelome génital mâle). Les individus sont hermaphrodites et la fécondation est interne. Le développement est direct. On rencontre des chaetognathes dans les eaux côtières aussi bien en Méditerranée qu'en Atlantique et en Manche.

c, crochet ; cc, couronne ciliaire ; e, épiderme ; i, intestin ; nc, nageoire caudale ; nl, nageoire latérale ; ov, oviducte ; rs, réceptacle séminal ; t, testicule ; vs, vésicule séminale ; y, yeux. (crédit X. Caubit)

Les chaetognathes constituent un petit phylum d'une centaine d'espèces. Malgré sa modestie, ce groupe suscite la curiosité des chercheurs depuis plus d'un siècle, car il ne trouve pas facilement sa place au sein de l'arbre des animaux bilatériens (les animaux dotés d'une symétrie bilatérale, à la différence des éponges et des méduses, par exemple). En 1844, Darwin mentionnait ainsi ces animaux « remarquables par l'obscurité de leurs affinités ». Par la suite, ils ont été classés dans un grand nombre de positions différentes. Avant l'avènement des phylogénies moléculaires, les zoologistes tendaient plutôt à les placer avec les Echinodermes (étoiles de mer), les Hémicordés et les Cordés (ascidies, Vertébrés) au sein du groupe des Deutérostomiens, c'est-à-dire les animaux dont la bouche se forme secondairement, et ne dérive jamais du premier orifice de l'embryon. Les chaetognathes présentent en effet ce caractère, ainsi qu'un autre caractère partagé par les Deutérostomiens : la formation du coelome par entérocoelie. Leurs cellules photoréceptrices les rapprochent également des Cordés. Toutefois, d'autres caractères les rapprochent des Protostomiens, l'autre grand groupe d'animaux bilatériens (Mollusques, Annélides, Arthropodes, Nématodes, etc.). C'est le cas de la position ventrale de la chaîne nerveuse et de la présence de chitine. Enfin, les études de phylogénie moléculaire, qui divergent parfois, s'accordent au moins sur un point : elles excluent l'appartenance des chaetognathes aux deutérostomiens sensu stricto. Toutefois, la fiabilité de ces travaux de ces travaux est limitée par l'artéfact de l'attraction des longues branches : l'évolution rapide des séquences des gènes étudiés jusqu'ici chez les chaetognathes conduirait à déporter cette lignée vers une position basale dans l'arbre.

Quoi qu'il en soit, les résultats préliminaires de l'analyse moléculaire s'accordent avec ceux de l'analyse morphologique : la mosaïque de caractères que présentent les chaetognathes est l'indice du caractère ancestral de cette lignée. La paléontologie témoigne également en ce sens, puisqu'on attribue à ce groupe des fossiles vieux de plus de 500 millions d'années (Chen & Huang). L'inclusion dans les Deutérostomiens étant exclue, plusieurs hypothèses demeurent possibles, parmi lesquelles :

La lignée des chaetognathes pourrait s'être individualisée très tôt, avant la divergence Protostomiens-Deutérostomiens. Ces animaux constitueraient alors un groupe de choix pour la reconstitution de l'ancêtre commun de tous les bilatériens (cela n'implique bien sûr pas que les chaetognathes ressemblent particulièrement à cet ancêtre).
La lignée des chaetognathes pourrait s'être individualisée après la divergence de la branche des Protostomiens. Ils s'enracineraient donc en position basale dans l'arbre des Protostomiens, en dehors des deux grands groupes que sont les Lophotrochozoaires (Mollusques, Annélides, Brachiopodes, etc.) et les Ecdysozoaires (Arthropodes, Nématodes, etc.) ; alternativement, ils pourraient trouver leur place au sein de l'un de ces groupes.

La détermination de la position phylogénétique des chaetognathes est d'une grande importance, car elle permet de polariser les caractères majeurs utilisés pour définir les Deutérostomiens. Dans les deux scénarios évoqués plus haut, la deutérostomie et l'entérocoelie seraient ainsi des caractères ancestraux (plésiomorphes) des bilatériens, hérités en commun par les chaetognathes et les Deutérostomiens, et perdus de façon plus tardive dans la branche des Protostomiens. On ne peut bien sur exclure l'hypothèse moins probable d'une acquisition convergente de la deutérostomie chez les chaetognathes et les Deutérostomiens.

La position phylogénétique des chaetognathes doit toutefois être précisée par l'étude de nouvelles séquences. Le projet de séquençage mis en oeuvre au Genoscope à l'initiative d'un consortium de trois laboratoires porte sur une collection d'étiquettes de séquences exprimées (EST). Il sera ainsi obtenu un nombre élevé de marqueurs moléculaires porteurs d'une information phylogénétique. La congruence des arbres obtenus avec ces différents marqueurs sera vérifiée. Cette utilisation des EST n'est pas la seule : les ADNc ont été préparés à partir de différents stades embryonnaires de Spadella cephaloptera, de sorte que le séquençage livrera sans doute de nouveaux gènes du développement (un gène Hox à la structure particulière a déjà été étudié (Papillon et al.,2003). Ce chaetognathe se prête bien aux méthodes d'analyse d'expression des gènes in situ, car les oufs et les embryons sont totalement transparents. Spadella cephaloptera vit dans les herbiers à posidonies, à faible profondeur et près du rivage ; les individus sont donc facilement accessibles. En outre, le cycle de reproduction de Spadella cephaloptera est entièrement maîtrisé par l'une des trois équipes et les différents stades du développement pré- et post-éclosion de cet animal sont bien caractérisés. L'analyse de l'expression de gènes d'intérêt à ces différents stades éclairera l'origine des mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement des métazoaires et leur évolution, en rapport avec la mise en place des différents plans d'organisation chez les bilatériens (paradigme « évo-dévo »).

Au niveau national, les équipes porteuses du projet ont réalisé une banque de clones BAC dans le cadre du groupement d'intérêt scientifique (GIS) « Génomique marine ». Cette banque permettra peut-être d'isoler le cluster de gènes Hox de Spadella cephaloptera et d'en tirer de nouvelles informations sur la mise en place des plans d'organisation. Les trois équipes sont également engagées, dans le cadre du sixième PCRD, dans un réseau de génomique marine où elles sont porteuses du modèle chaetognathe.

Bibliographie

J.Y. Chen & D.Y. Huang, Science (2002) 298, 187

D. Papillon et al., Dev. Genes Evol. (2003) 213, 142-148

D. Papillon et al., Mol. Biol. Evol. (2004) 21, 1-8

K.G. Helfenbein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2004) 101, 10639-10643