Stratégies de séquençage

2/ Le séquençage « clone par clone »

Une stratégie différente - dite « clone par clone » ou hiérarchique - a été adoptée par divers consortiums internationaux pour le séquençage du génome humain et d’autres grands génomes (riz, arabette, ver, …). L’assemblage des lectures chevauchantes n’est plus réalisé à l’échelle de l’ensemble du génome, mais à l’échelle de grands fragments génomiques (appelés abusivement « clones »), préalablement ordonnés en une carte. Cette compartimentation permet de diminuer la difficulté posée par les séquences répétées et, surtout, de diriger le travail de « finition » sur des régions précises. Cette étape de finition est indispensable dans la perspective d’une annotation exhaustive et précise de la séquence.

Cartographie

La contrepartie est un effort de cartographie pour ordonner les grands fragments génomiques (voir la fiche Cartographie). Ce travail fait appel à diverses ressources : marqueurs des cartes physiques et génétiques, assemblage des grands fragments chevauchants sur la base de leur profil de coupure par des enzymes (« fingerprint »), et enfin séquences d’extrémités des grands fragments. Cette dernière ressource peut être utilisée pour construire la carte des grands fragments de proche en proche, à mesure que le séquençage progresse, et pour choisir les fragments chevauchants les moins redondants en vue du séquençage.

Avec un volume de séquences lues équivalant à 5 ou 6 fois la taille d’un génome comme celui de l’être humain (profondeur de 5X), il est possible d’assembler clone par clone une « ébauche » où l’on obtient pour chaque clone quelques dizaines de contigs. Toutefois, ces contigs initiaux ne sont en général ni ordonnés, ni orientés. En augmentant la profondeur jusqu’à

10X, on obtient des contigs plus longs, moins nombreux, et surtout ordonnés et orientés grâce aux paires de lectures ou à d’autres informations. Reste alors à entreprendre une étape fastidieuse de lissage et de finition, pour garantir à tout endroit moins d’une erreur tous les 10 000 nucléotides, et pour boucher les trous résiduels par un travail local.