Podospora anserina

Abondance de modèles ne nuit pas

Fructifications de Podospora anserina. Après épuisement du milieu de culture, la reproduction sexuée a lieu : la fécondation est suivie de la formation de fructifications, les périthèces. Au sein de ces structures protectrices spécialisées se produisent la caryogamie (la fusion du noyau mâle et du noyau femelle) puis la méiose et enfin la formation des asques, qui contiennent chacun quatre ascospores binucléées. Quatre jours environ après la fécondation, les ascospores sont éjectées à l’extérieur du périthèce.

Le champignon filamenteux ascomycète Podospora anserina est un organisme modèle, utilisé pour l’étude génétique et moléculaire de plusieurs processus biologiques. Le vaste phylum des Ascomycètes comprend des espèces aux modes de vie très divers ; plusieurs sont cultivées en laboratoire et étudiées en tant que modèles par d’importantes communautés de chercheurs. Parmi les espèces modèles dont les génomes sont déjà séquencées, Neurospora crassa est la plus proche de Podospora anserina. Ces deux champignons appartiennent au même ordre, celui des Sordariales, au sein de la classe des Sordariomycètes. Les lignées de Neurospora et de Podospora auraient divergé depuis au moins 75 millions d’années.

En tant qu’espèce modèle, Neurospora crassa a été rendue célèbre par son rôle dans la naissance de la biologie moléculaire. C’est en effet grâce à la génétique de Neurospora que George W. Beadle et Edward Tatum ont pu établir la célèbre relation "un gène - une enzyme". Toutefois, le modèle Podospora anserina a été préféré de ce côté-ci de l’Atlantique, grâce aux travaux pionniers de Georges Rizet. Initiée par ces travaux, une riche tradition de génétique microbienne s’est constituée en France autour de Podospora et d’autres champignons filamenteux (Ascobolus immersus, Sordaria macrospora...), notamment à la faculté des sciences d’Orsay.

Podospora anserina est trouvé dans la nature sur les excréments d’herbivores. Cette espèce pratique la reproduction sexuée, avec un cycle haplobiontique (le noyau diplo&iauml;de issu de la caryogamie subit immédiatement la méiose) d’environ une semaine. Chez cet organisme haplo&iauml;de, les mutations sont donc mises en évidence facilement et rapidement. Les asques contiennent 4 spores, chacune contenant 2 noyaux haplo&iauml;des.

L’étude de Podospora anserina montre qu’on aurait tort de se limiter à un unique modèle tel que Neurospora crassa. Malgré leur relative proximité, les deux espèces présentent en effet des différences importantes. Podospora donne accès à d’autres phénomènes biologiques que Neurospora. En particulier, les hyphes de Podospora anserina subissent un phénomène de sénescence qui a établi ce champignon, depuis des décennies, comme un modèle d’étude des mécanismes du vieillissement. Chez Neurospora crassa, au contraire, la sénescence n’est pas observée de façon systématique. Par ailleurs, Podospora anserina ne présente pas
 ou présente avec une efficacité moindre - les phénomènes d’extinctions géniques qui sont particulièrement efficaces chez Neurospora crassa, ce qui permet de développer chez le premier des technologies impossibles à mettre en oeuvre chez le second.

Processus biologiques étudiés chez Podospora anserina

Parmi les processus biologiques fondamentaux étudiés chez Podospora anserina, on peut citer :

• Les dégénérescences cellulaires, et le rôle d’éléments infectieux non conventionnels dans ces syndromes et dans la sénescence.
• Le contrôle de la fidélité de la traduction dans le cytosol, qui est impliqué dans la sénescence et qui jouerait notamment un rôle important dans la stabilité de ces éléments infectieux.
• L’instabilité du génome mitochondrial, cause de dysfonctionnements des mitochondries que l’on trouve dans bon nombre de myopathies humaines, et son association avec le processus de sénescence, peut-être par l’intermédiaire de la fidélité de la traduction des protéines mitochondriales dans le cytosol.
• La relation entre la sénescence et la fonction respiratoire dont la mitochondrie est le siège. Il s’agit là d’un thème que l’on retrouve dans l’étude du vieillissement chez d’autres espèces.
• Un phénomène de mort cellulaire nommé incompatibilité végétative, qui suit la fusion de cellules somatiques d’individus génétiquement incompatibles.
• La présence d’un prion, capable de s’agréger en fibres amylo&iauml;des tout comme dans les encéphalopathies spongiformes et la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l’homme, et qui pourrait jouer un rôle dans l’incompatibilité végétative.
• Le contrôle du développement au cours du cycle sexué et la différenciation cellulaire.
• L’évolution des systèmes de reproduction sexuée et de la pluricellularité.

Les raisons du séquençage

Un nombre important de gènes impliqués dans ces différents processus ont été localisés, car Podospora anserina se prête bien à l’analyse génétique. Toutefois, peu de ces gènes ont été pour l’instant caractérisés au niveau moléculaire. Le séquençage du génome de Podospora anserina accélérera ces recherches en permettant :

• De faciliter le clonage des gènes. Avec la disponibilité de la séquence complète, il sera déjà plus facile, dans les cas où l’on sait ce que l’on cherche, de cloner un morceau de séquence par PCR ou de le trouver dans les banques utilisées pour le séquençage et qui sont maintenant disponibles. Dans le cas contraire, la séquence génomique sera également utile : à l’heure actuelle, le clonage d’un gène de Podospora anserina par complémentation d’un mutant peut prendre jusqu’à un an ; or ce temps pourrait être réduit d’un facteur 10 par une procédure de clonage positionnel. On sait d’ores et déjà que Podospora anserina présente des micro et minisatellites polymorphes d’une population à une autre. Les gènes candidats repérés dans un intervalle entre certains de ces marqueurs pourraient alors être testés par complémentation fonctionnelle après transformation.
• D’améliorer l’annotation de la séquence du génome de Neurospora crassa, et plus généralement celle des autres champignons filamenteux. En retour, la séquence génomique de Neurospora crassa facilitera bien sûr l’annotation de Podospora anserina.
• D’engager des études comparatives sur le génome de ces champignons filamenteux, puis d’étendre les comparaisons aux génomes des levures, et, au delà, à ceux des métazoaires (les animaux constituent le groupe frère des champignons) et des plantes (dont les stratégies de vie sont similaires à celles des champignons). Il est à ce titre intéressant de souligner que les champignons filamenteux possèdent davantage de protéines homologues de protéines humaines que n’en possèdent les levures.
• D’envisager la mise au point de puces à ADN échantillonnant l’ensemble des gènes de Podospora anserina en vue de l’étude des profils d’expression génique associés aux différents phénomènes cellulaires caractérisés chez ce champignon.

Le génome de Podospora anserina comprend 7 chromosomes. Sa taille, estimée par une analyse par électrophorèse en champ pulsé, est d’environ 34 Mb. Ce génome serait donc plus petit que celui de Neurospora crassa - 40 Mb environ -, qui a été séquencé en 2003 à une profondeur de plus de 10X. Parmi les autres champignons filamenteux séquencés à ce jour, citons Magnaporthe grisea - un autre sordariomycète - et, moins étroitement apparentés à Podospora, les espèces Fusarium graminearum, Aspergillus nidulans, Aspergillus fumigatus, Phanerochaete chrysosporium et Coprinus cinereus. Les génomes d’autres espèces encore, pour la plupart des pathogènes de l’homme ou de plantes, sont en voie d’être séquencés.

L’historique du projet

Dès septembre 2000, le Genoscope s’était engagé dans un projet pilote, portant sur la région centromérique du chromosome V de Podospora anserina. Ce projet avait été proposé fin 1999 par quatre laboratoires travaillant sur ce champignon. Leur but était d’étudier la faisabilité d’un projet de séquençage intégral. A la fin du projet pilote en janvier 2002 ont été obtenus deux contigs d’une taille cumulée de 480 kb, qui ont permis d’établir la valeur de 50% du pourcentage en GC de Podospora et la rareté des séquences répétées. Ces données sont favorables dans la perspective d’un séquençage aléatoire global (whole genome shotgun). Par ailleurs, ce projet pilote a aussi révélé la compacité du génome (gènes espacés de 1 kb en moyenne) et la petite taille moyenne des introns (60 pb), ce qui constituera un atout lors de l’annotation. Le gain immédiat du projet pilote a été l’identification de deux gènes impliqués dans des dégénérescences cellulaires, et de plus de 160 autres gènes à partir desquels ont été définis divers consensus pour l’identification des introns et des séquences codantes. Enfin, ces séquences devraient aider à l’identification d’un centromère de champignon filamenteux en vue de la construction d’un vecteur non intégratif pour ce type d’organisme.

Le projet de séquençage intégral a démarré en 2003 dans le cadre de l’appel à proposition «  séquençage à grande échelle  » du ministère de la recherche et des nouvelles technologies. Un financement a été alloué initialement pour la production au Genoscope d’un volume de séquence de 3X. Le projet est désormais étendu à un séquençage aléatoire global du génome de Podospora anserina à une profondeur de 10X. L’initiative en revient au conseil scientifique du Genoscope et à un consortium de 5 équipes françaises et d’une équipe néerlandaise (voir Collaboration), coordonné par l’équipe " Contrôle génétique de dégénérescences cellulaires " de l’Institut de Génétique et Microbiologie (UMR CNRS 8621) à l’université d’Orsay - Paris Sud. Le projet a en outre reçu l’appui de l’institut fédératif de recherche «  Génome  » du centre d’Orsay - Gif-sur-Yvette.

Outre la finition de la séquence génomique, le consortium «  Podospora  » se chargera de l’annotation. L’extrapolation à partir des séquences annotées dans le projet pilote indique la présence d’environ 11 000 gènes dans le génome de ce champignon. L’annotation profitera des séquences de clones d’ADNc de Podospora anserina également déterminées au Genoscope. Elle bénéficiera en outre de la comparaison avec le génome de Neurospora crassa, qui apparaît situé à la bonne distance évolutive pour que les deux génomes puissent être comparés par la procédure Exofish développée au Genoscope : plus de 95 % des gènes déjà repérés chez Podospora ont un homologue chez Neurospora, alors qu’introns et séquences intergéniques ne sont pas conservés. Les régions évolutivement conservées indiquées par Exofish correspondront donc à des exons avec une sensibilité et une spécificité élevée.

Philippe Silar et al. (2003) Characterization of the genomic organization of the region bordering the centromere of chromosome V of Podospora anserina by direct sequencing, Fungal Genetics and Biology 39 n�3, pages 250-263.

Les équipes associées au sein du consortium «  Podospora  » sont :

• L’équipe «  Contrôle génétique de dégénérescences cellulaires  » de l’Institut de Génétique et Microbiologie (IGM, UMR CNRS 8621) à l’université d’Orsay.
• L’équipe «  Reproduction sexuée, traduction et différenciation  » de l’IGM à l’université d’Orsay.
• L’équipe «  Sénescence et longévité chez P. anserina  » au Centre de Génétique Moléculaire (CGM) du CNRS à Gif-sur-Yvette.
• Le laboratoire de génétique moléculaire des champignons à l’Institut de Biochimie et Génétique Cellulaires (IBGC, UMR CNRS 5095) de l’université Bordeaux II.
• Le laboratoire "Réplication et expression des génomes eucaryotes et rétroviraux" (REGER) de l’université Bordeaux II.
• Le Laboratoire de génétique de l’université de Wageningen.