Oryza sativa

Le Genoscope participe à l’effort international de séquençage du génome du riz (Oryza sativa) en déterminant la séquence du chromosome 12 de cette céréale. Le cultivar de riz retenu par le consortium international IRGSP est la variété Nipponbare, ou GA3, de la sous-espèce japonica. Le chromosome 12 de Nipponbare est long de 30 millions de nucléotides (Mb) (l’ensemble des douze chromosomes de Nipponbare représente 430 Mb). Le Genoscope séquence également une région télomérique du chromosome 11, qui correspond à une duplication entre le chromosome 11 et le chromosome 12.

Le Genoscope et les autres centres du consortium ont retenu l’approche du shotgun hiérarchique, dite encore « clone par clone », qui repose sur l’établissement d’une carte physique préalable du génome. Les ressources de cartographie physiques disponibles au début du projet provenaient de deux centres :

Lorsque le Genoscope s’est engagé dans le projet de séquençage du chromosome 12, il disposait donc de ces clones et de ces données de cartographie physique pour déterminer un chemin de recouvrement (« tiling path ») minimal sur l’ensemble du chromosome. En 1999, le travail a démarré dans le cadre d’un projet pilote avec le CIRAD, l’IRD, le CNRS et l’Université de Perpignan : 11 premiers BAC ont été sélectionnés comme points d’entrée sur le chromosome 12. Le séquençage devait progresser de part et d’autre de ces "points de nucléation", et d’autres à venir, choisis le long du chromosome sur la base d’un espacement optimal des marqueurs. Dans cette stratégie nommée STC (Sequence Tag Connectors), à chaque fois qu’un clone est séquencé, on le compare aux séquences d’extrémités des clones de la banque pour sélectionner des clones au chevauchement minimal  ; on retient alors, grâce aux données de fingerprint, le clone qui s’étend le plus loin pour le séquencer à son tour. Le chemin de recouvrement minimal est ainsi construit à mesure que le séquençage progresse. Le processus s’interrompt lorsque deux fronts de progression en directions opposées se rejoignent.

Le scénario initial pour la conduite du projet a été modifié en 2000 après l’annonce par Monsanto de la réalisation d’une ébauche du génome de Nipponbare. L’entreprise américaine avait confié ce travail à l’équipe de Leroy Hood à l’université Washington à Seattle. A partir d’une banque de plus de 75 000 clones BAC séquencés à leurs extrémités et analysés par fingerprint, le groupe de Lee Hood a retenu près de 3 500 de ces clones pour former un chemin de recouvrement et les a séquencés à une profondeur de 5X. Monsanto a fini par mettre une partie de ces données, sous certaines conditions, à la disposition de l’IRGSP. Ainsi, en mars 2001, le Genoscope a obtenu les données de séquence des 148 clones Monsanto assignés au chromosome 12 ainsi que la banque de clones BAC utilisée, les données de séquences d’extrémité et de fingerprint et l’accès à un serveur BLAST regroupant la totalité des séquences obtenues par Monsanto. Nous avons alors entrepris de fusionner l’ensemble des données publiques et privées afin de réaliser le séquençage du chromosome 12 à moindre coût.

Pour commencer, nous avons vérifié l’ancrage des clones BAC de Monsanto sur le chromosome 12 par une série d’hybridation avec des sondes dérivées des marqueurs. Les séquences des 148 clones Monsanto assignés au chromosome 12 ont ensuite été comparées aux séquences d’extrémités des BAC du CUGI, ce qui nous a permis de positionner 127 BAC Monsanto sur 20 contigs de fingerprint du CUGI. Afin de confirmer l’intégration des BAC Monsanto, nous les avons soumis à une nouvelle analyse de fingerprint avec les clones du CUGI. Sur ces 127 clones Monsanto, 82 ont été retenus pour commencer à construire le chemin de recouvrement minimal, avec les 11 clones du projet pilote. Ces 82 clones Monsanto ne représentaient que 12 Mb sur les 30 Mb du chromosome 12. Dans les régions non couvertes par des clones Monsanto, nous avons déterminé de nouveaux points d’entrée par une seconde série d’hybridations en utilisant les marqueurs génétiques localisés dans ces régions. Enfin, nous avons dérivé des sondes à partir des séquences d’extrémités des contigs de clones CUGI déjà ancrés sur le chromosome 12 afin d’identifier de nouveaux contigs.

Le séquençage de ces premiers clones a commencé fin novembre 2001 (dans le cas des clones Monsanto, séquencés à 5X, un séquençage complémentaire était nécessaire pour les porter à 10X). De nouveaux BAC provenant de Monsanto ou du CUGI ont ensuite été sélectionnés par l’approche STC. Dans tous les cas, leur intégrité était vérifiée par analyse de leur colinéarité avec les BAC voisins. L’assemblage de la séquence de chaque BAC est validé par la comparaison des profils de restriction théoriques, déduits de la séquences, avec ceux obtenus expérimentalement. En octobre 2002, la mise à disposition des contigs de l’ébauche génomique produite par la société Syngenta a permis de faciliter le travail de finition. Les données de Syngenta ont été intégrées de façon automatique dans les BACs en cours de finition.

A l’été 2003, le chemin minimal de recouvrement défini pour le chromosome 12 comporte 265 clones BAC, représentant 27 Mb de séquence unique. Seuls demeurent 3 trous de cartographie correspondant au centromère et aux 2 télomères. La région dupliquée à l’extrémité du chromosome 11 est quant à elle couverte par 6 clones. Toutes les séquences des clones séquencés au Genoscope sont soumises à la section HTG de la base de données EMBL pour les clones en phase 1 et 2, et à la section PLN pour les clones finis.