Oryza sativa

Qu’est ce que Tos17 ?

Les rétrotransposons Ty1-copia appartiennent à la classe des rétroéléments à longues répétitions terminales (LTR), qui transposent selon un mécanisme de copier/coller via un intermédiaire ARN et forment la fraction majoritaire des régions intergéniques chez les plantes supérieures (Bennetzen 2000). Tos17 est un élément ty1-copia du riz qui appartient à une famille de 32 membres , et dont 5 membres ont été trouvés actifs (Tos10, 17, 19, 25 et 27) (Hirochika et al. 1996, Hirochika 2001).

Tos17 est le membre le plus actif de cette famille et existe en un faible nombre de copies dans le génome du riz (1 à 10 selon les variétés) du fait que sa transposition est strictement régulée au niveau transcriptionnel en conditions naturelles de culture. Lors de la dédifférenciation cellulaire liée à la culture de tissus, l’activation de l’élément est induite et résulte en un accroissement du nombre de copies en fonction de la durée de culture in vitro (Hirochika et al. 1996, Hirochika 2001). Après la régénération des plantes, l’activation est inhibée et les nouvelles copies de l’élément sont héritées de façon stable aux descendances.

En raison de ces caractéristiques favorables, Tos17 a été utilisé pour la mutagenèse insertionnelle de la céréale modèle (Hirochika 2001). La variété Nipponbare, qui a été sélectionnée comme le cultivar standard par l’international rice genome sequencing project (IRGSP, 2005) porte seulement deux copies par génome haploïde localisées sur les chromosomes 7 et 10 et une moyenne de 10 copies transposées de Tos17 dispersées sur l’ensemble du génome est observée de façon typique à partir de plantes régénérées à partir de cultures de cals de 5 mois. Une collection de 51.625 lignées régénérées de riz portant 510.000 insertions ont été produites au National Institute for Agrobiological Sciences (NIAS) au Japon (Miyao et al. 2003). 20.000 insertions ont déjà été caractérisées par le séquençage des régions génomiques adjacentes aux nouveaux sites d’intégrations de Tos17, permettant de rechercher directement une insertion dans un gène favori pour en étudier la fonction.

Quel est l’état d’avancement de la mutagenèse insertionnelle chez le riz ?

Les collections de lignées d’insertion constituent une des ressources les plus nécessaires pour découvrir et valider la fonction des gènes au travers de stratégies de génétique directe et inverse. Les systèmes d’éléments transposables du maïs Ac/Ds et En/Sp, le rétrotransposon endogène Tos17 et l’ADN-T sont les principaux mutagènes insertionnels chez le riz. La mutagenèse ponctuelle ou de délétion a également été développée en association avec le TILLING pour rechercher des lésions dans des gènes ? Un effort important de coordination des initiatives nationales de mutagenèse (Corée, Australie, Japon, Chine, Taiwan, Singapour, USA , Philippines, France a été lancé au travers d’un consortium international sur la génomique fonctionnelle du riz et un projet international de criblage de ces collections pour des caractères associés avec la tolérance à a été mandatée par le Generation Challenge Program. La collection de lignées d’insertion produite dans le cadre du programme Genoplante, qui est rendue accessible à la communauté internationale avec la disponibilité des grains est reconnue comme un contributeur majeur dans ce réseau international. Comme pour Arabidopsis il est cependant vraisemblable que la plupart des échanges auront lieu sur la base de l’indexation par les séquences de régions flanquantes (FST). Ceci est renforcé par les réglementations internationales de quarantaine et de biosécurité qui régissent les échanges internationaux de semences de riz.

A la différence de la communauté Arabidopsis qui bénéficie à présent d’une couverture du génome entier par des sites d’insertion avec environ 300.000 FST publiques la communauté riz qui a à faire avec un génome quatre fois plus important (même si les 3 mutagènes insertionnels ont été montrés comme ayant une préférence d’insertion dans les régions riches en gènes) a encore besoin de plus de sites d’insertion caractérisés, que l’on estime aujourd’hui à 100.000 FST pour 200.000 lignées produites. Pour faciliter une recherche par génétique inverse un navigateur base sur GGB qui contient toutes les données publiques de FST a été développé (Droc et al. 2006).

Quels sont les objectifs du projet ?

Une collection de 30.000 lignées d’insertions de riz a été produite par co-culture de cals embryogènes de la variété Nipponbare – dont le génome a été utilisé par le programme international de séquençage (IRGSP 2005)-, grâce à un effort inter institutionnel (Cirad, Cnrs, Inra et Ird) financé par le programme de génomique végétale Génoplante (Sallaud et al 2004).

Ces lignées sont en cours de multiplication et d’évaluation dans le cadre d’une collaboration avec le CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical situé à Cali en Colombie) pour fournir des grains à la communauté internationale et détecter des variations en conditions agronomiques, tandis que d’autres projets de criblage de mutations (par exemple la réponse aux pathogènes ou le remplissage du grain) ont également été conduits. La validation de la fonction de plusieurs gènes est en cours. Parallèlement, plus de 20.000 séquences des régions adjacentes à la bordure gauche des inserts ADN-T ont été produites.

Comme la procédure de transformation du riz inclut une phase de culture in vitro relativement courte, il est estimé que les 30.000 lignées de la collection Genoplante contiennent un total de 90.000 nouvelles insertions de l’élément Tos17 (3.2 en moyenne par lignée). Une nouvelle méthode d’amplification sélective à haut débit des régions adjacentes aux nouveaux inserts Tos17 - appelée TOSTRAP – a été développée. En utilisant le protocole TOSTRAP, nous avons pu amplifier les régions flanquantes d’au moins une nouvelle copie de l’élément Tos17 dans 20.000 lignées. Des fragments PCR ayant une taille variant entre 300 pb et 2000 pb (taille moyenne de 700 pb) qui contiennent une séquence étiquette permettant d’utiliser une unique amorce pour séquencer tous les produits PCR, sont amplifiés. Le protocole permet d’amplifier des produits PCR multiples à partir d’un même échantillon d’ADN dans 25% des cas. 75% des produits PCR sont donc des produits simples et 25% des produits multiples (dans la plupart des cas deux fragments PCR).

Le projet prévoit de séquencer ces 20.000 produits PCR pour rapidement transférer à la communauté scientifique internationale de nouvelles FST pour les stratégies de génétique inverse et améliorer la couverture du génome assurée par la collection.

La collection de lignées d’insertion Genoplante est utilisée à la fois par la communauté scientifique nationale et internationale impliquée dans la recherche en génomique du riz et des céréales. Il existe en France une communauté bien structurée sur le riz de plus de 30 (INRA, IRD, CIRAD, CNRS) établie dans la région Languedoc-Roussillon et conduisant des projets de génomique fonctionnelle sur la réponse aux pathogènes (UMR BGPI 385), le développement et remplissage du grain et l’embryogenèse (UMR GDP 5096), le développement végétatif de la plante et son adaptation aux stress (UMR PIA 1096). Les communautés privée et publique travaillant sur le blé (INRA) et le maïs (BIOGEMMA) qui font également partie du consortium utilisent une approche de génomique comparative avec le riz comme pivot pour son génome séquencé et ses ressources associées. Un intérêt grandissant existe également dans la communauté scientifique Arabidopsis pour valider la fonction des gènes favoris dans le riz. La collection est aussi une ressource centrale pour les projets internationaux comme ceux du Generation Challenge Program (CEREALIMMUNITY et STRESS MUTANT) comme pour des projets financés par la commission européenne (CEDROME). Les FST de Tos17 produites par ce projet fourniront de nouvelles étiquettes pour l’ensemble de ces projets et communautés.

Contacts : Corinne Cruaud (Genoscope) - Emmanuel Guiderdoni (CIRAD)

Bibliographie

Bennetzen JL (2000) Plant Mol Biol 42:251-269

Hirochika H. (2001) Curr Opin Plant Biol , 4:118-122

Hirochika H et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93 : 7783- 7788

Miyao A et al (2003) Plant Cell, 15, 1771-1780

Sallaud C et al (2004) Plant J. 39, 450-464

IRGSP (2005) Nature, 436 :793-800