Laboratoire de Métagénomique des procaryotes

Présentation

Exploration de la diversité microbienne dans les procédés d’épuration des eaux à boues activées
Le monde microbien a longtemps été étudié par des méthodes basées sur l’isolement et la culture de bactéries. Ces techniques classiques de culture n’ont permis de caractériser qu’une petite collection d’espèces. Ces bactéries cultivables ne représentent qu’une faible partie des bactéries présentes dans tous les environnements naturels et forment la base de la plupart de nos connaissances concernant la diversité microbienne et de la microbiologie.
Les progrès de la biologie moléculaire ont permis de mettre en évidence l’énorme étendue de la diversité microbienne dans tous les habitats naturels. Ces travaux, basés pour la plupart sur la séquence des ADN ribosomiques 16S (Pace, 1997) montrent l’existence de nombreuses espèces inconnues (Bacteria ou Archaea) considérées comme non cultivables, puisque n’ayant jamais été isolées à partir de prélèvements de milieux naturels. C’est aussi la séquence d’ADNr 16S qui sert à établir des liens phylogénétiques entre les différentes espèces ainsi identifiées (Woese et al., 1990).
Cette approche, qui a le mérite de reconstituer une phylogenèse du monde bactérien et archaeaen assez bien acceptée, est insuffisante pour explorer et mettre en évidence l’étendue de la diversité microbienne.


Cloaca maxima

La biodiversité ne se limite pas à l’ADNr. Elle est le reflet des différentes façons par lesquelles les micro-organismes obtiennent leur énergie, interagissent dans l’environnement, etc. C’est cette grande diversité génique et métabolique que nous voulons appréhender.

Bassins de la station d’épuration d’Evry. Photo de P. Ginestet, P. Carmacho (Suez Environnement)

Le projet Cloaca maxima, cherchant à contribuer à l’inventaire des gènes procaryotes, a démarré durant l’année 2000. Notre choix s’est porté sur les différents bassins du processus d’épuration des eaux usées d’origine domestique pour des raisons fondamentales et pratiques.

Sur le plan fondamental, ces milieux sont le siège d’une intense activité métabolique dont le résultat est de convertir une grande partie des substances organiques polluantes en composés minéraux et en biogaz. Les stations d’épuration sont une succession de boîtes noires, dégradant les polymères, les polluants, la matière organique, éliminant le phosphore. C’est aussi le lieu de l’élimination de l’ammoniaque par les réactions de nitrification-dénitrification et du processus anammox.

Boues d’épuration de la station d’Evry. Photo de P. Ginestet, P.Carmacho (Suez Environnement)

Le processus d’épuration est important sur le plan pratique. L’accroissement de la population et des activités industrielles engendre de nouvelles pollutions et des besoins croissants de retraitement des déchets, en particulier des eaux usées. Les techniques actuelles d’épuration se basent sur l’utilisation de micro-organismes actifs (formant ce que l’on appelle les boues activées) dans l’absorption et/ou la dégradation de matières dissoutes ou en suspension (organiques, minérales, etc.) ainsi que dans des phénomènes de décantation et d’agrégation. L’identification des acteurs microbiens de l’épuration des eaux est un travail essentiel pour comprendre, maîtriser et prévenir les dysfonctionnement des stations d’épuration. Le processus d’épuration des eaux et sa dernière étape : la digestion anaérobie sont des éléments clefs du développement durable.
Nous avons centré notre exploration sur les bassins de la stations d’épuration d’Evry qui traite essentiellement des eaux résiduaires urbaines.

Objectifs

Diversité
Le premier objectif de Cloaca maxima est de dresser un inventaire aussi exhaustif que possible des micro-organismes présents aux différentes étapes du traitement des eaux usées. Cet inventaire repose sur le clonage et l’analyse des séquences d’ADNr 16S amplifiées par PCR a partir de l’ADN extrait du milieu. Dans le but de dresser un inventaire assez complet de la microflore et d’avoir une image de la diversité réelle, nous avons utilisé des amorces générales ciblant l’ADNr des domaines Archaea ou Bacteria (Woese et al., 1990), ou bien des amorces spécifiques de divisions du domaine Bacteria peu ou pas représentées par des micro-organismes cultivables, telles que les Planctomycètes, Verrucomicrobiales, Acidobactériales ou les divisions candidates WS6, BCR1 et SAR11. Les produits de PCR sont ensuite séparés par clonage et séquencés. Nous avons ainsi analysé plus de 4 000 séquences issues d’échantillons des différents compartiments (aérobie, anoxie et digesteur mésophilique) de la station d’épuration.

Exploration du métagénome
Le second objectif de Cloaca maxima est l’exploration du métagénome ; c’est-a-dire l’ensemble des génomes des micro-organismes (bactéries et archaea) présents dans un environnement naturel (Rondon & al, 2000).
Les principaux buts sont de contribuer de façon massive à l’inventaire des gènes procaryotes, d’initier un inventaire des activités enzymatiques et des processus métaboliques.
Dans ce but, deux grandes banques métagénomiques (1,5 millions de clones au total) ont été construites a partir de l’ADN extrait de deux environnements différents : une banque de BACs a partir du bassin aérobie et une banque de fosmides a partir du digesteur anaérobie mésophile. Le séquençage systématique des extrémités des inserts a été entrepris et pour chacune de ces lectures les ORFs (phase ouverte de lecture) ont été déterminées.


Résultats :

Une grande diversité de micro-organismes a été clonée sous forme de BACs et de fosmides. Ainsi, outre des représentants d’Archaea, des fragments génomiques de 23 divisions bactériennes ont été clonés et, parmi elles, 8 divisions candidates n’ayant pas encore de représentant cultivé. La méthode de criblage que nous avons mis au point nous a également permis de mettre en évidence l’existence de bactéries appartenant a une nouvelle division bactérienne candidate : WWE3. Des représentants de WWE3 ont détectés par PCR dans 19/52 digesteurs anaérobies analysés (Allemagne, Espagne, France, Irlande, Italie, Mexique, République Tchèque, Suisse).

Des BACs et des fosmides, identifiés par leur séquence d’ADNr 16S et dont la position phylogénétique est d’un intérêt particulier (lignée n’ayant pas encore de représentant cultivable, par exemple), ont été choisis pour être séquencés. Ainsi, la séquence de fosmides, affiliés à divers phylotypes de WWE1 (division candidate bactérienne récemment décrite, Chouari et al., 2005), a été entièrement établie afin d’explorer leurs niveaux de similarité. Partant d’un fosmide contenant un ADNr 16S de WWE1, nous avons alors cherché à étendre cette région par un processus d’assemblage itératif. Cette méthode nous a permis de reconstituer le génome complet d’un représentant de la lignée WWE1 : " Candidatus Cloacamonas acidaminovorans ".
L’ensemble de ces données va nous permettre d’étudier de façon approfondie les différences entre le bassin aérobie et le digesteur anaérobie. Un intérêt particulier sera porté au métabolisme de l’anaérobiose, système bien moins caractérisé que la vie aérobie.

Bibliographie :

• Pace NR.
  "A molecular view of microbial diversity and the biosphere".
  Science. 1997 May 2 ;276(5313):734-40. Review.
• Rondon MR, August PR, Bettermann AD, Brady SF, Grossman TH, Liles MR, Loiacono KA, Lynch BA, MacNeil IA, Minor C, Tiong CL, Gilman M, Osburne MS, Clardy J, Handelsman J, Goodman RM.
  "Cloning the soil metagenome : a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms".
  Appl Environ Microbiol. 2000 Jun ;66(6) : 2541-7.
• Woese CR, Kandler O, Wheelis ML.
  "Towards a natural system of organisms : proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya".
  Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Jun ;87(12):4576-9.