Oikopleura dioica

Les tuniciers, chordés invertébrés

L’organisme marin Oikopleura dioica est intéressant à plus d’un titre. Tout d’abord, la famille des Oikopleuridés, à laquelle appartient ce minuscule animal, arrive en deuxième position parmi les groupes d’animaux les plus abondants du plancton de l’ensemble des mers. Ensuite, Oikopleura dioica possède le plus petit génome connu à ce jour parmi les animaux - 72 Mb seulement. Cela en fait un organisme de choix pour un projet de séquençage, d’autant qu’il peut être facilement et rapidement multiplié en captivité. Enfin et surtout, Oikopleura dioica appartient au phylum des Chordés, dont font également partie les Vertébrés. Sa position phylogénétique le rend particulièrement intéressant pour l’étude génomique de l’émergence des Vertébrés et de leurs caractéristiques fondamentales.

Larve d’Oikopleura en cours d’organogenèse

Simplicité anatomique d’une larve d’Oikopleura dioica en cours d’organogenèse après quatre heures de développement : les cellules du muscle (en haut) et du système nerveux central (en bas) sont révélées par hybridation in situ avec deux sondes ARN.

Apparus il y a au moins 600 millions d’années, les Chordés sont des animaux munis d’une chorde (ou corde, ou notocorde), une tige dorsale de cellules turgescentes dont la rigidité assure une fonction de soutien dans l’axe de l’animal. Ils se distinguent également par la possession d’un tube neural dorsal. Le phylum des Chordés comprend trois sous-phylums : les Urochordés, ou Tuniciers, auxquels appartient Oikopleura dioica ;les Céphalochordés, représentés par le célèbre amphioxus, petit animal marin en forme de poisson ; et les Vertébrés, groupe frère des Céphalochordés, chez qui la corde disparaît au cours du développement et est remplacée par la colonne vertébrale. Au sein des Tuniciers, Oikopleura appartient à la classe des Appendiculaires. Ces animaux conservent leur corde tout au long de leur vie. Ils se distinguent en cela d’autres tuniciers, les ascidies, dont les larves nageuses à l’allure de têtard présentent une corde, mais subissent une métamorphose au terme de laquelle cette structure est perdue : les ascidies adultes sont des animaux fixés à l’allure de sac en lesquels il est difficile de reconnaître des cousins des vertébrés.

L’intérêt pour les chordés invertébrés a redoublé lorsqu’on a confirmé que les bases moléculaires de nombreux aspects du développement des vertébrés sont conservées chez ces animaux. Par exemple, le gène Brachyury joue un rôle similaire dans le développement de la queue chez les vertébrés et chez les tuniciers, tandis que l’homologue du gène Pax-2 chez les tuniciers intervient, comme chez les vertébrés, dans l’établissement de la frontière entre mésencéphale et rhombencéphale. Des aspects complexes du développement des vertébrés, comme la mise en place du système nerveux central, pourraient donc être étudiés avec profit chez ces animaux plus simples que sont les chordés invertébrés.

Oikopleura dioica, tunicier modèle

La « maison » à laquelle le genre Oikopleura doit son nom (grec Oikos : maison, foyer) est une logette gélatineuse qui abrite l’animal tout en lui permettant de filtrer l’eau de mer. Les protéines constitutives de la maison, les oikosines, sont sécrétées par un épithélium spécialisé, dit oikoplastique. Chez Oikopleura dioica, la maison est entièrement renouvelée toutes les 3 ou 4 heures.

Les organismes les plus étudiés parmi les Céphalochordés et les Urochordés sont respectivement les amphioxus Branchiostoma floridae et belcheri et plusieurs espèces d’ascidies, parmi lesquelles Ciona intestinalis, dont le génome de 160 Mb a fait l’objet d’un projet de séquençage en 2001 et 2002. L’amphioxus ne peut être reproduit en captivité, ce qui limite son intérêt comme modèle. Ciona intestinalis, en revanche, a déjà fait l’objet de nombreux travaux, du fait de son maintien plus aisé en aquarium, de son embryogenèse rapide et de la facilité à suivre la différenciation cellulaire chez la larve. Toutefois, l’adulte est un animal relativement gros, fixé, très différent de la larve, comme on l’a déjà indiqué, puisqu’il a perdu le plan d’organisation typique des chordés. En outre, la génétique chez Ciona est encore très peu développée.

Le choix d’Oikopleura dioica comme tunicier modèle est motivé par plusieurs caractéristiques qui rendent l’étude de ce tunicier très complémentaire de celle de Ciona. Tout d’abord, comme chez tous les appendiculaires, l’adulte, issu d’une métamorphose moins sévère que chez Ciona, conserve un plan d’organisation de chordé, en particulier une queue mobile (bien qu’il vive dans une logette gélatineuse sécrétée par l’épiderme), ce qui le rapproche des vertébrés. L’adulte est très petit (cinq millimètres au total, avec un tronc d’un millimètre), et des centaines d’individus peuvent être aisément produits dans de simples béchers d’eau de mer pourvus en microalgues. A cela s’ajoute un temps de génération extrêmement court (quatre jours à 20 �C, contre trois mois pour Ciona intestinalis).

Oikopleura dioica possède une remarquable fécondité, comme l’illustre l’image de cette femelle en train de pondre.

Des méthodes pour maintenir et croiser ces animaux ont été développées au centre Sars à Bergen en Norvège et une lignée pure a d’ores et déjà été obtenue par des croisements répétés entre individus apparentés. L’ensemble de ces caractéristiques confère à Oikopleura dioica (objet central ou annexe des recherches d’au moins huit groupes dans le monde) un potentiel important pour des études génétiques d’une grande ampleur, rapprochant de la puissance des modèles invertébrés que sont la drosophile et le ver Caenorhabditis elegans. En outre, des méthodes de transgénèse utilisant des vecteurs rétroviraux sont en cours de mise au point au centre Sars. Enfin, un atout majeur d’Oikopleura dioica est son génome de 72 Mb seulement, le plus petit connu dans le monde animal. Cette valeur correspond à une estimation par cytométrie de flux et a été confirmée par la suite par diverses statistiques sur les séquences génomiques (voir ci-dessous) ; elle traduit la compacité importante du génome (très faible taille des séquences intergéniques et des introns), qui est un avantage pour un projet de séquençage, tant au niveau de l’assemblage (par la réduction de la difficulté causée par les séquences répétées) qu’au niveau de l’annotation.

Historique du projet de séquençage

L’image de ce mâle adulte illustre l’un des avantages du modèle Oikopleura dioica : cet animal demeure transparent tout au long de son cycle de vie.

La découverte de la petite taille du génome d’Oikopleura dioica a conduit dès 1999 le centre international de biologie marine Sars (Bergen, Norvège) à fonder ses travaux sur des données de séquençage à grande échelle. Deux groupes, celui de Daniel Chourrout et celui d’Eric Thompson, travaillent au Sars sur Oikopleura dioica et ont déjà obtenu des résultats importants sur l’organisation du génome et de la chromatine, le développement, le cycle cellulaire et l’expression des gènes. Les chercheurs du Sars ont obtenu le soutien du Max Planck Institute for Molecular Genetics (MPIMG) à Berlin (département de Hans Lehrach) pour un premier effort de séquençage aléatoire. L’assemblage de ces premières lectures shotgun début 2002 a donné 44 000 contigs couvrant 41 Mb du génome d’Oikopleura. Ces lectures aléatoires ont permis en outre de confirmer, via leur degré d’assemblage et leur alignement sur des collections d’EST et de BAC, la petite taille du génome, avec des estimations qui sont même inférieures à 70 Mb. Le MPIMG a également séquencé 25 clones BAC contenant des gènes intéressants, tels que les gènes Hox.

En 2003, le Sars a décidé de prolonger cet effort initial de séquençage en proposant au Genoscope un projet de séquençage aléatoire global d’une profondeur de 10 X : le but est cette fois d’obtenir un assemblage couvrant l’ensemble de la partie euchromatique du génome. L’assemblage devrait tirer un grand bénéfice de l’utilisation d’une lignée pure, une opportunité pour le moment unique chez les invertébrés deutérostomes (ce n’est en effet le cas ni de Ciona, ni des amphioxus, ni des deux oursins en cours de séquençage).

Intérêts du génome d’Oikopleura dioica en génomique comparative

Quels enseignements sur les innovations des chordés pourront-ils être tirés de l’analyse du génome d’Oikopleura dioica ? Les résultats obtenus sur l’ébauche génomique de Ciona intestinalis en donnent un aperçu. L’annotation de Ciona, ainsi que l’analyse préliminaire des données de séquence d’Oikopleura, indiquent que les deux tuniciers possèdent aux alentours de 15 000 gènes, soit environ la moitié du nombre de gènes des vertébrés. Cela refléterait l’importance des événements de duplication génique survenus dans la lignée des vertébrés, après leur séparation du reste des chordés. Les gènes de Ciona et d’Oikopleura possèdent donc un degré de redondance moindre que ceux des vertébrés, ce qui est un atout pour des expériences de génomique fonctionnelle.

Le séquençage et l’annotation d’une région génomique de 140 kb clonée dans un BAC ont permis d’illustrer la très forte compacité du génome d’Oikopleura dioica. Au total, pas moins de 33 gènes sont prédits, dont 29 sont confirmés par étude d’expression. Les rectangles rouges représentent les exons et les rectangles verts représentent les sequences répétées.

Peut-on pour autant considérer que les génomes des deux tuniciers correspondent au génome du chordé ancestral, dernier ancêtre commun à l’ensemble des chordés ? Une ascidie comme Ciona intestinalis est un organisme hautement spécialisé, qui a sans doute perdu de nombreux gènes de ce cordé ancestral et en a acquis d’autres depuis la divergence de sa lignée. La distance importante entre Ciona et Oikopleura, ainsi que leurs différences notables d’organisation, permettront d’obtenir une bien meilleure représentation de l’identité génétique des urochordés et du résultat de leur adaptation diversifiée, mais aussi de leurs différences avec les vertébrés et les invertébrés non chordés. Grâce à ces informations, on pourra imaginer avec plus de précision ce qu’était le génome de l’ancêtre commun de tous les chordés. La comparaison avec les génomes d’autres invertébrés révélera les gènes apparus spécifiquement dans la lignée des chordés, tandis que la comparaison avec les génomes des deux poissons et des deux mammifères séquencés à ce jour révélera les gènes apparus tôt dans la lignée des vertébrés (en premier lieu, gènes neuraux et gènes primordiaux du système immunitaire adaptatif).