Leptosphaeria maculans

Introduction

Verse parasitaire d’un champ de colza due à Leptosphaeria maculans (photo CETIOM)

Les champignons sont des eucaryotes d’une importance primordiale sur les plans écologique, biotechnologique, médical et économique. La petite taille et la compacité de leur génome en font des modèles de choix pour l’analyse de fonctions difficiles à appréhender chez des modèles animaux plus complexes (rythmicité cellulaire, par exemple). Ils sont particulièrement utiles dans l’agro-industrie (champignons comestibles, fermentations, etc.) et dans les biotechnologies (enzymes, métabolites, pharmacie). Enfin, ce sont des pathogènes d’importance chez l’animal et l’homme, mais ce sont aussi les principaux agents pathogènes des plantes cultivées. A ce titre, ils sont la cible d’une lutte chimique intensive qui est de moins en moins acceptable, tant sur le plan économique que sur le plan environnemental.

Parmi les quelques 250 000 espèces fongiques identifiées, 75 % sont des Ascomycètes. Ce vaste phylum contient au moins trois classes de champignons filamenteux particulièrement spécialisées dans la pathogenèse vis-à-vis des plantes. La plus importante est sans conteste la classe des Dothidéomycètes, qui comprend au minimum 3500 espèces ; elle regroupe la plupart des espèces les plus dommageables au niveau international sur les grandes cultures (septorioses du blé, Phoma du colza, etc.), les arbres fruitiers (tavelure du pommier, etc.) ou les cultures vivrières (Ascochyta des légumineuses, raies noires du bananier, etc.).

Leptosphaeria maculans, un phytopathogène représentatif de stratégies parasitaires complexes

Asques de Leptosphaeria maculans contenant les ascospores à 6 cellules typiques de l’espèce (photo D. Zickler, IGM Orsay)

Leptosphaeria maculans, agent de la « nécrose du collet » des crucifères, est particulièrement dommageable sur colza (Brassica napus) : chez cette plante de grande culture, la maladie, aussi connue sous le nom de « Phoma du colza », cause en France de 5 à 20% de pertes de rendement moyen (voir la photo de la verse provoquée dans une culture de colza). Pathogène majeur, L. maculans est en outre un organisme modèle, car il est exemplaire de la biologie et de la pathogenèse des Dothidéomycètes. Il développe successivement :

1. une phase de vie saprophyte pouvant durer plusieurs années, durant laquelle il se nourrit de débris végétaux et effectue sa reproduction sexuée (voir la photo des asques issus de la fécondation) ;
2. une phase parasitaire nécrotrophe très brève sur feuilles de crucifères (voir photo), durant laquelle L. maculans initie une phase de multiplication asexuée ;
3. une colonisation systémique des espaces intercellulaires des tissus végétaux, qui est cette fois biotrophe (le champignon exploite les cellules végétales sans les tuer) ; cette phase dure plusieurs mois et résulte en une colonisation massive des tissus du collet et de la racine des plantes ;
4. une ultime phase nécrotrophe, qui va se traduire par une nécrose chancreuse de la base de la tige (« stem canker », voir photo) et qui aboutit à la verse de la plante.

Le symptôme primaire de la maladie : les macules foliaires développées à l’automne sur feuilles de colza au champ. Les macules portent des pycnides contenant des conidies, spores issues de la multiplication asexuée (Photo T. Rouxel, INRA)

Leptosphaeria maculans a donc probablement conservé l’ensemble des gènes nécessaires à ces différents styles de vie : vie saprophyte (avec ses exigences quant à la nutrition, à la compétition avec la microflore du sol, etc.), vie parasitaire qui implique la dégradation des tissus végétaux vivants (enzymes de dégradation, toxines), et enfin colonisation cryptique qui requiert l’absence de reconnaissance par la plante (facteurs suppresseurs ?). Une telle polyvalence fait de ce champignon un modèle très original par rapport à des pathogènes plus spécialisés, chez qui le parasitisme a entraîné la perte de fonctions devenues inutiles (reproduction sexuée, compétition avec d’autres saprophytes, etc.). Le fait que les « programmes » biologiques ou phytopathologiques de L. maculans se mettent en place successivement est un atout supplémentaire pour des approches de génomique fonctionnelle de la pathogenèse et pour l’étude des signalisations et régulations responsables des modifications de style de vie.

Les traits de vie très tranchés de L. maculans supposent en outre une forte adaptabilité dans la nutrition et les modes d’acquisition des éléments nutritifs. Au-delà de cette adaptabilité, L. maculans a développé des spécificités très étroites avec ses plantes-hôtes, basées sur des relations « gène-à-gène » entre le pathogène et la plante. Il existe en effet des gènes de L. maculans - gènes dits d’avirulence - dont le produit est reconnu par certaines variétés de plantes hôtes dotées de gènes de résistance spécifiques ; cette reconnaissance limite le développement pathogène du champignon dans la plante et protège cette dernière de la maladie.

Nécrose du collet sur plantes de colza au champ (peinture originale de M. Huau, 1950, Fonds documentaire unité PMDV, INRA)

Enfin l’importance de la reproduction sexuée dans le cycle vital de L. maculans conduit à une recombinaison génétique très rapide et très efficace des caractères, pertinente pour des études d’évolution moléculaire des gènes soumis à pression de sélection.

Leptosphaeria maculans, une « bête de laboratoire »

D’un point de vue « pratique », L. maculans présente également de nombreuses caractéristiques qui en font un modèle de laboratoire informatif et facile à étudier :

• Génome « compact » de petite taille (autour de 34 Mb).
• Organisme haplo&iauml;de.
• Culture en conditions axéniques et conservation à long terme des individus (plusieurs dizaines d’années au moins).
• Développement aisé et rapide de la génétique in vitro (hétérothallisme, grande fertilité, temps de génération de 2 mois, analyse de tétrades possible).
• Résolution de l’ensemble du caryotype par électrophorèse (au moins 16 chromosomes, compris entre 0,6 et 3,5 Mb).
• Phénotypage aisé, notamment dans le cas des traits liés au pouvoir pathogène, pour lesquels la relation « gène-à-gène » conduit directement au génotype. Pour connaître le génotype au locus de gènes d’avirulence, on infecte un ensemble de variétés de colza (cotylédons, stade plantules) qui expriment différents gènes de résistance.
• Transformation au moyen d’Agrobacterium tumefaciens (agrotransformation), permettant en particulier l’expression de gènes « rapporteurs » (GFP).

Pour travailler sur Leptosphaeria maculans, de nombreux outils sont aujourd’hui disponibles, en particulier à l’INRA à Versailles : collections extensives de souches naturelles ou de descendances, collections de transformants obtenus par agrotransformation, vecteurs améliorés pour la disruption génique, cartes génétiques, banques BACs (couverture de l’ordre de 24 X du génome fongique), etc. Enfin, les génomes de deux Dothidéomycètes très proches de L. maculans, le pathogène du blé Stagonospora nodorum et le pathogène des Brassica Alternaria brassicicola, seront prochainement séquencés dans leur intégralité grâce à des initiatives publiques (équipes de Richard Oliver à l’université Murdoch, Australie, et de Christopher Lawrence au Virginia Bioinformatics Institute, USA). Ces séquences fourniront des bases solides pour de futures approches de génomique comparative, visant en particulier à mieux comprendre l’évolution des traits liés à la pathogenèse et à la spécificité parasitaire chez les Dothidéomycètes.

Processus biologiques et phytopathologiques étudiés chez Leptosphaeria maculans

Parmi les principaux processus étudiés chez le champignon modèle Leptosphaeria maculans (et sans préjuger des travaux effectués en parallèle sur la plante-hôte), on peut citer :

• la spécificité parasitaire liée aux gènes d’avirulence, la signification évolutive du regroupement de ces gènes dans le génome, et la façon dont ils évoluent sous pression de sélection (INRA-Versailles) ;
• la fonction des gènes d’avirulence et l’effet de la perte de cette fonction sur la « fitness » du pathogène (INRA-Versailles) ; les conséquences pour la gestion des résistances variétales chez le colza (thématique abordée dans le cadre du projet européen SECURE) ;
• la structure et l’évolution des centromères de L. maculans ; les conséquences sur le polymorphisme de taille des chromosomes généré par la méiose (INRA-Versailles) ;
• l’identification de gènes impliqués dans le processus infectieux par analyse de collections de transformants générés par mutagenèse aléatoire (université de Melbourne, INRA-Versailles) ;
• l’analyse transcriptomique et protéomique de l’interaction avec les Brassica ou avec Arabidopsis thaliana ;
• l’organisation et la fonction d’un cluster de gènes impliqués dans la synthèse de phytotoxines (univ. Melbourne ; univ. Saskatchewan) ;
   la détoxication des composés de défense de plantes (phytoalexines) (université du Saskatchewan).

Objectifs du projet de séquençage

Le développement, chez de nombreuses espèces phytopathogènes, de spécificités strictes de type « gène-à-gène » avec les plantes-hôtes a des conséquences majeures en termes économiques et cognitifs. De telles spécificités strictes ont conduit les sélectionneurs à utiliser des gènes de résistance dits « spécifiques » chez la plante. Celle-ci est alors totalement protégée contre le pathogène ; en contrepartie, ces gènes de résistance exercent des pressions de sélection très fortes sur les populations pathogènes auxquelles il suffit souvent d’une mutation ponctuelle pour contourner la résistance variétale. Ainsi, dans le cas de Leptosphaeria maculans, nous avons montré que l’utilisation à grande échelle du gène de résistance Rlm1 dans le colza (reconnaissance spécifique des champignons de génotype AvrLm1) a conduit en trois années seulement à un contournement de la résistance. Lorsqu’on s’engage dans des programmes de sélection variétale de longue haleine, un tel contournement se traduit par une absence de rentabilité économique pouvant menacer à terme l’ensemble des efforts de sélection sur cette espèce végétale.

La relation gène-pour-gène, telle qu’elle est exprimée sur cotylédons de colza : exemple de la confrontation entre une souche exprimant (ou non) le gène d’avirulence AvrLm1 et une plante exprimant, ou non, le gène de résistance correspondant, Rlm1

D’un point de vue cognitif, on connaît actuellement très peu de choses sur les gènes d’avirulence fongiques, leur fonction intrinsèque, leur rôle dans la biologie du champignon, la façon dont ils sont reconnus par les gènes de résistance de la plante, la façon dont ils évoluent lorsqu’ils sont soumis à une pression de sélection, et les conséquences que cela peut avoir sur la biologie du champignon. En fait, parmi les ascomycètes, on n’a caractérisé à ce jour que 10 gènes d’avirulence chez seulement 3 espèces, et aucune similarité de structure ou de fonction putative n’a été observée entre ces différents gènes.

L’équipe INRA de Versailles a développé une approche de clonage positionnel pour isoler chez L. maculans de tels gènes d’avirulence (notés AvrLm). Parmi les 8 gènes AvrLm cartographiés à ce jour, 6 sont organisés en 2 clusters de 3 gènes chacun, dans des régions génétiquement indépendantes du génome fongique. La cible principale de l’équipe de Thierry Rouxel est le cluster de trois gènes d’avirulence AvrLm1-AvrLm2-AvrLm6. Plusieurs raisons expliquent ce choix :

• l’intérêt du clonage d’AvrLm1, du fait de l’efficacité de la résistance associée Rlm1 dans les cultures de colza en France.
• l’histoire très différente de la pression de sélection subie par ces trois gènes dans les conditions de culture européenne : AvrLm2 a été confronté à la résistance Rlm2 dès l’origine de la culture du colza, alors qu’AvrLm6 n’a jamais été confronté à Rlm6.
• la variabilité importante de la taille du chromosome qui porte ce cluster (de 1,90 à 2,80 Mb selon les souches), en rapport avec l’évolution de la virulence (voir plus bas).

Grandes étapes du projet de séquençage

Ascospores germant sur une feuille de colza, observées en microscopie électronique à balayage (Photo AM Jaunet & MH Balesdent, INRA)

L’analyse génétique a permis d’encadrer le cluster AvrLm1-AvrLm2-AvrLm6 par deux marqueurs de la carte génétique distants de 9,8 cM. Ces marqueurs, utilisés pour sonder une banque de clones BAC, ont permis en outre d’encadrer physiquement le cluster par deux contigs de BAC.

En 2000, une première collaboration entre l’équipe de l’INRA de Versailles et le Genoscope a abouti au séquençage du contig de clones BAC bordant le cluster en 5’ chez la souche française JN3 (génotype AvrLm1 avrLm2 AvrLm6). L’analyse de cette région génomique de 184 kb a révélé sa structure particulière : riche en A+T, elle est majoritairement constituée de mosa&iauml;ques de rétrotransposons dégénérés (en particulier par des phénomènes de type "Repeat Induced Point mutation"-RIP) et n’abrite qu’une petite zone de 32 kb riche en ORFs. Le contig contenait trois marqueurs coségrégeant avec AvrLm1, mais l’espoir de cloner directement ce gène d’avirulence a été déçu : il est situé en 3’ du contig, et sa liaison absolue avec des marqueurs pourtant distants entre eux de quelques centaines de kilobases résulte d’un déficit de recombinaison dans cette région (voir plus bas).

L’équipe de Thierry Rouxel a alors poursuivi la marche chromosomique en 3’ du contig initial ; elle a procédé par criblage PCR de pools de BAC, en utilisant des SNP d’éléments répétés dégénérés définis à partir des premières données de séquence. Cet effort a permis de délimiter une région génomique de près de 1 Mb (sur les 2,8 Mb du chromosome), contenant certainement les gènes AvrLm1, AvrLm6, et, sans doute, AvrLm2. Cette région partage les mêmes caractéristiques structurelles et génétiques que la zone flanquante en 5’ (sous-représentation dans les banques génomiques, richesse en A+T, petits ilôts d’ORFs isolés, rareté des événements de recombinaison méiotiques). Ces caractéristiques sont clairement celles d’un centromère régional, structure dont le noyau central est flanqué de zones hétérochromatiques pouvant s’étendre sur plusieurs centaines de kilobases. Les centromères régionaux sont caractéristiques des eucaryotes supérieurs, mais restent très mal connus, quels que soient les organismes, à cause des difficultés rencontrées pour les cloner, les séquencer, assembler les séquences et les annoter.

Les analyses génétiques et la caractérisation des populations naturelles de L. maculans, virulentes ou avirulentes au locus AvrLm1, ont par ailleurs permis aux chercheurs de l’INRA de mettre en évidence :

1. une zone de 210 kb où les événements de recombinaison sont particulièrement rares, puisqu’elle correspond à moins de 1 cM (alors que la moyenne de la carte génétique est de 8 kb par cM)
2. une région de 530 kb environnant AvrLm1 qui fait l’objet de délétions majeures liées à la perte du phénotype avirulent. Ces délétions peuvent atteindre 210 kb, et expliquent pleinement le polymorphisme de taille du chromosome correspondant.

Cette région péricentromérique, qui réduit drastiquement la recombinaison méiotique des gènes qu’elle abrite, pourrait constituer une « zone génomique refuge » pour des gènes impliqués dans la pathogenèse et/ou l’avirulence.

En 2003, le Genoscope a entrepris de séquencer l’intégralité de la région péricentromérique abritant AvrLm1, AvrLm6 et probablement AvrLm2. Le matériel séquencé est le contig de BACs de 1 Mb issu de la souche JN3, produit d’un croisement in vitro entre souches européennes (AvrLm1 avrLm2 AvrLm6). Parallèlement, le Genoscope séquence des BACs issus de deux autres souches : NZ-T (avrLm1 avrLm2 AvrLm6), souche naturelle isolée en Nouvelle-Zélande, et v29 (avrLm1 AvrLm2 avrLm6), souche qui résulte d’un croisement in vitro et qui comprend une souche australienne dans sa généalogie. Contrairement à JN3, ces souches, de génotype avrLm1, sont virulentes vis-à-vis du colza Rlm1, et permettront une première comparaison des allèles virulents et avirulents au locus AvrLm1. Pour NZ-T et v29, le séquençage ne portera que sur les contigs de BACs construits pour les zones riches en G+C, susceptibles d’abriter les gènes.

Une fois la séquence assemblée, il s’agira d’établir un inventaire des gènes présents et d’identifier des candidats pour les fonctions d’avirulence, mais aussi des gènes de pathogénie putatifs. De même, il s’agira de caractériser la structure globale de cette région, en particulier le degré de conservation de la mosa&iauml;que d’éléments répétés : on pourra ainsi valider l’hypothèse selon laquelle cette région évolue par des délétions majeures au niveau de « hot spots », délétions qui expliqueraient l’acquisition de virulences et le polymorphisme chromosomique. Au-delà de ces connaissances générées directement par le projet, le séquençage permettra d’entreprendre les travaux suivants :

• Clonage des gènes AvrLm1 et AvrLm6, validation fonctionnelle et caractérisation (fonction, cinétique d’expression, régulation de l’expression et localisation cellulaire des produits).
• Evolution moléculaire des gènes d’avirulence et génération de virulence (collaboration INAPG) : les données de séquence obtenues donneront une première indication des évènements ayant conduit, chez des souches virulentes, au gain de la virulence avrLm1. Après identification du gène lui-même, un séquençage des allèles dans les populations naturelles sera entrepris en interne.
• Sur la base des séquences d’allèles virulents et avirulents, génération de marqueurs moléculaires pour l’identification et le suivi des races « virulentes » avrLm1 et avrLm6.
• Sur la base des séquences de la trentaine de gènes identifiés dans cette région, et après confrontation aux ADNc correspondants, analyse structurelle des gènes de Leptosphaeria maculans pour une aide future à l’annotation dans le contexte d’un projet de séquençage du génome.